料水比对农业废弃物稻草和猪粪生物预处理及厌氧消化的影响

钟 斌，沈 飞，李汉广，夏 祥，王艳玲，张庆华

（江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌330045）

【研究意义】中国是一个传统的农业大国，每年生产粮食产生的农作物秸秆约8亿t，畜禽粪便干物质量高达3.3亿t[1]。迄今为止，大多数秸秆和畜禽粪便的处置方式仍然是直接焚烧或排入水体。秸秆的焚烧不仅会造成空气污染，而且会破坏土壤表层的微生物生长环境，使土壤的营养流失，肥力下降[2]。随意排放的畜禽粪便在厌氧环境中会产生多种有毒有害物质，危害人体健康。反之，如果利用得当，这些农业废弃物可转废为宝形成巨大的经济效益。为此，开发与探索新的处置方法是提高当前农业废弃物利用率的关键。【前人研究进展】目前，国内外对利用农作物秸秆厌氧消化产甲烷的研究比较多[3-6]，而畜禽粪便则主要用作有机肥[7]。有研究[8]尝试将畜禽粪便进行单一的厌氧消化，然而由于畜禽粪便碳氮比较低，单一地将其进行厌氧消化会导致氨氮含量过高从而对厌氧消化产生抑制[9]。因此有学者[10-12]根据农作物秸秆高碳氮比和畜禽粪便低碳氮比的特性将二者进行厌氧共消化，取得了不错的效果。然而，秸秆中含有大量的纤维质，纤维质分子内部有复杂的分子间氢键网络，可以有效阻止纤维质被降解[13]，这是制约农作物秸秆厌氧消化的主要因素之一。由于纤维质的难降解性，目前利用秸秆来进行的厌氧消化大都需要对秸秆进行预处理，常见的预处理方法有物理法、化学法[14]和生物法[15-16]。虽然物理和化学预处理方法可以提高秸秆的消化效率，但是二者都需要额外的耗材且易产生二次污染，因而很少用于农业废弃物的预处理。相比之下，生物预处理以其不消耗额外试剂，能耗低，处理条件温和等优势，逐渐成为人们关注的热点。生物预处理又分为单一菌株的预处理和复合菌系预处理，与单一菌株的预处理相比，复合菌系的预处理依靠微生物间的协同作用实现对纤维质的高效转化，可以分泌多种酶系对不同的底物都有较好的降解效果，并且对环境依赖性不高[17]。近年来，采用复合菌系对农业废弃物进行生物预处理受到学者广泛关注。【本研究切入点】纤维质的降解效果能显著影响厌氧消化，而影响复合菌系降解纤维质活性的因素有料水比、接种量、预处理时间等[18]。就料水比而言，料水比过高会使得环境中的营养成分难以被微生物摄取，水解生成的某些毒性物质不易被稀释，从而导致微生物生长受到抑制；过低的料水比降低了发酵体系中营养物质的浓度，使得微生物营养不足，不能充分利用反应器的空间，造成水解效率低下[19-20]。因此，探究出一个合适的料水比进行生物预处理对厌氧消化效率的提高有着重要意义。【拟解决的关键问题】目前关于料水比对复合菌系预处理以及后续厌氧消化效果影响鲜见报道，本研究以农业废弃物猪粪稻草为原料，以前期定向构建的纤维素降解复合菌系[21]为预处理手段，将预处理后的稻草和猪粪作为底物进行厌氧消化，探究不同料水比条件下经过生物预处理后的稻草和猪粪联合厌氧消化的产气特性，以期为农业废弃物的资源化利用提供新的方向。

1 材料及方法

1.1 试验材料

稻草于2017年6月取自江西农业大学试验田早稻秸秆，秸秆风干后粉碎备用；猪粪取自江西农业大学动科院生猪养殖场；厌氧污泥取自新余罗坊沼气站。上述研究材料及接种物的基本性质如表1所示，本试验进行的时间为2017年10月到2018年1月。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基 活化培养基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，NaCl 5 g，CaCO30.9 g，滤纸5 g，猪粪1.8 g，蒸馏水1 L，pH 7.6，灭菌备用。

1.2.2 复合菌系的活化 将前期筛得的纤维素降解复合菌系以10%（V/V）的接种量接种至活化培养基，于55℃的培养箱静置培养36 h。

1.2.3 复合菌系预处理 控制C/N比为30∶1，称取总质量为9.9 g的稻草和猪粪，按照7%、11%、15%、19%的料水比（W/V）加入不同体积的蒸馏水，调节pH为7.6，以10%的接种量（V/V）添加活化好的菌液，于55℃培养箱静置培养30 h。上述预处理操作均设置3个重复试验。预处理结束后以8 000 r/min离心10 min取上清测定其中的滤纸酶活、CMC酶活（carboxymethy cellulose enzyme activity）、化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）等参数。

1.2.4 厌氧消化 取300 mL厌氧污泥，加入预处理好的稻草和猪粪混合物（包括发酵液及残渣），调节pH至7.2，密封后通3 min氮气以除去瓶中氧气，于（35±1）℃恒温水浴锅中静置培养，每12 h手动摇晃蓝口瓶1 min使瓶中反应物混合均匀，以未经复合菌系预处理的稻草和猪粪混合物作为对照组底物重复以上操作。以上厌氧消化设置3个重复试验，同时取300 mL污泥且不加稻草和猪粪进行厌氧消化，以排除污泥自身产气的干扰。用排NaOH法收集气体以测定甲烷产量[21]，停止产气后，将发酵液以8 000 r/min离心5 min取上清测定其中的还原糖、氨氮、碱度等参数。

表1 试验材料的基本性质Tab.1 Basic properties of experimental materials

1.3 分析方法

TS、VS、COD的测定参照APHA方法[22]；使用雷磁PHS-3C pH计测定pH；使用排NaOH法测定产气量[21]；总有机碳的测定采用马弗炉灰化法[23]；氨氮的测定采用靛酚蓝反应法[24]；总氮的测定采用凯氏定氮法[23]；使用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法测定还原糖的含量[24]；碱度的测定采用溴甲酚绿-甲基红指示剂滴定法[25]；有机酸采用比色法测定[25]；滤纸酶活和CMC酶活见参考文献[21]；纤维素、半纤维素、木质素的测定采用范式洗涤法[26]。

1.4 数据处理

本研究所有数据处理均使用软件Origin 9.1处理。

2 结果与讨论

2.1 料水比对稻草和猪粪预处理过程关键酶酶活的影响

有研究显示，复杂底物的生物可降解性和沼气潜力取决于可生物降解的碳水化合物（包括纤维素、半纤维素和木质素组分）的含量[27]，纤维质的水解阶段是厌氧消化的限速步骤[28]，Dai等[29]的研究表明纤维素酶活在纤维质水解过程中起着重要的作用。通常，用CMC酶活表示微生物对纤维质的降解能力，而滤纸酶活代表了总木质纤维素的降解能力[18]。由图1可见，料水比对酶活有着显著影响，随着料水比的提升，CMC酶活和滤纸酶活都呈现先上升后下降的趋势，当料水比控制在11%时，发酵液的滤纸酶活和CMC酶活最高，分别达到0.901 IU和1.197 IU。该结果表明11%的料水比比较适合复合菌系的预处理，这可能是由于在高料水比的环境下，复合菌系分解纤维质产生的毒性物质不能被稀释，进而对酶活产生影响；而更低的料水比则会影响复合菌系吸收环境中的营养物质，不利于分泌酶系。

图1 不同料水比条件下关键酶酶活Fig.1 Key enzyme activity under different ratio of material to water

2.2 不同料水比条件下预处理及厌氧消化中间代谢产物的变化

COD能反映有机物的相对含量，由图2（a）可见，经过36 h的预处理之后，预处理组的COD随着料水比的提升先上升后下降，11%料水比条件下的预处理液中COD含量最高，为8 234 mg/L；经过厌氧消化后，各料水比条件下的消化液中COD均处于3 800～4 200 mg/L。这可能是因为厌氧消化阶段，产甲烷会消耗大量的有机物，此外，微生物生长也会消耗有机物导致COD的下降。

在厌氧消化的第二阶段，也就是酸化阶段，酸化细菌会将水解阶段生成的小分子物质如还原糖等分解成有机酸等产物，供产氢产酸阶段使用[30]。由图2（b）可见，预处理结束后，随着料水比的提升，各预处理组还原糖含量呈现先升高后下降的趋势，且11%料水比条件下的预处理液中还原糖的浓度（160.76 mg/L）最高。这可能是因为在11%料水比条件下降解纤维质的两种关键酶酶活较高，因而能够降解底物产生更多的还原糖。

不同料水比条件下预处理和厌氧消化的有机酸含量和pH如图2（c）所示，经过36 h的预处理后，各预处理组有机酸含量均处于1 400～2 300 mg/L，这可能是因为预处理过程中产生的还原糖等物质会被产乙酸菌利用，导致预处理液中的有机酸含量显著升高，其中，11%料水比条件下的预处理液有机酸含量最高，为2 270 mg/L，这可能与该料水比条件下复合菌系分泌酶的活性有关。有研究表明预处理液中的有机酸成分主要是乙酸[31]。乙酸的大量积累会使得厌氧消化的产气高峰提前到来，这对缩短厌氧消化的时间有着极其重要的意义。经过厌氧消化以后，系统中的有机酸被大量消耗，有研究表明系统中残余的有机酸可能是丙酸，这可能是因为丙酸的降解需要吸收较高的自由能，无法自发进行[32]。随着料水比的提升，预处理组的pH先下降后上升，这与有机酸的含量有关，在11%料水比条件下，pH最低，为6.62；经过厌氧消化后，实验组和对照组的pH均为7.5左右，上述结果表明整个系统的pH在预处理过程和厌氧消化过程均处于厌氧消化适宜的pH（6.5～8.5）。说明稻草猪粪经过复合菌系预处理后具有较好的pH自我调节能力和稳定性。

碱度具有中和系统中的有机酸防止系统过快酸化的作用，有研究表明，当有机酸与碱度之比为0.5以下时，厌氧消化系统的系统稳定性比较好[33]。由图2（c）和（d）可见，随着料水比的提升，各预处理组碱度普遍较低，均不高于3 200 mg/L（以CaCO3计），经复合菌系预处理稻草和猪粪进行厌氧消化，发酵液碱度均高于6 000 mg/L，这可能是因为厌氧消化过程利用了大量的蛋白质和氨基酸类物质，产生了氨氮类物质，使碱度上升[34]。此时，各实验组有机酸与碱度的比值分别为0.063、0.065、0.101、0.142，仍远低于0.5，这表明经过纤维素复合菌系预处理以后的稻草和猪粪在厌氧消化阶段稳定性较好。

氨氮是影响厌氧消化的重要因素之一，在厌氧消化过程中，氨氮主要通过降解蛋白质和氨基酸等物质积累。有研究表明，低于200 mg/L的总氨氮对微生物的生长是有利的，因为微生物可以利用氨氮作为生长代谢的氮源，但是当氨氮浓度超过1 500 mg/L时，厌氧消化将会受到抑制[35-36]。由图2（e）可见，经过预处理后，各预处理液中的氨氮浓度都比较低，均处于600 mg/L以下，这说明在厌氧消化初期系统中的氨氮不会对其造成抑制。并且在厌氧消化结束以后，各处理组的实验组中的氨氮浓度仍低于1 500 mg/L，说明经过预处理后，氨氮浓度不会对厌氧消化产生抑制作用。

图2 各料水比条件下发酵液的COD（a）、还原糖（b）、有机酸和pH值（c）、碱度（d）和氨氮（e）变化情况Fig.2 Changes of COD（a），reduction of Sugar（b），Organic Acid and pH Value（c），alkalinity（d）and ammonia nitrogen（e）in fermentation broth under different ratio of material to water

2.3 料水比对稻草和猪粪预处理后厌氧消化产甲烷的影响

有文献[37]报道，不同底物进行厌氧消化产甲烷通常具有两个产气高峰，不同料水比条件下的日产气量如图3（a）所示，各处理组均有两个很明显的产气高峰，这与文献所报道的结果一致。第一个产气高峰出现的可能是因为稻草和猪粪经过预处理后积累了大量的可溶性有机质，在厌氧消化时可以被甲烷菌快速利用；第二个产气高峰的出现可能是因为预处理阶段积累的有机质消耗完毕后甲烷菌开始利用纤维质等较难降解的物质。在11%料水比条件下，经过复合菌系预处理后的稻草猪粪进行厌氧消化时的产气峰值（153 mL），并且高峰持续时间（7d）最长。此外，经复合菌系预处理后的稻草和猪粪进行厌氧消化时能够更快的进入产气高峰期，由图3（a）可见，各实验组均在第1天到达产气高峰，而未经复合菌系预处理的稻草和猪粪进行厌氧消化时均在第3天达到产气高峰期，表明复合菌系预处理在缩短厌氧消化时间和提高甲烷产量方面有着巨大优势。

累积甲烷产量和甲烷产率如图3（b）和（c）所示，11%料水比条件下预处理的稻草和猪粪混合物厌氧消化后，累积甲烷产量为1 778 mL，甲烷产率为283.12 mL/（g·VS），该结果比对照组提高了41%，分别比7%、15%和19%料水比条件下的实验组产气提高了27.63%、30.93%和58.75%。这可能是因为在11%的料水比条件下，稻草和猪粪经过复合菌系预处理累积了大量的有机酸和还原糖。上述结果表明，在11%的料水比条件下，稻草和猪粪经复合菌系预处理后表现出更强的产气潜力。

图3 不同料水比预处理对厌氧消化产甲烷的影响Fig.3 Effect of pretreatment with different ratio of material to water on methane production in anaerobic digestion

3 结论

本研究以农业废弃物稻草和猪粪为原料，研究了不同料水比条件下经过生物预处理后对厌氧消化的影响。结果表明，将稻草和猪粪在11%料水比条件下进行复合菌系预处理，滤纸酶活（0.901 IU）和CMC酶活（1.197 IU）最高，经此料水比条件下预处理后的稻草和猪粪混合物进行的厌氧消化效果最佳，产气高峰提前2d到来，高峰持续7d，甲烷产率高达283.12 mL/（g·VS），比对照组提高41%。表明纤维素降解复合菌系在农业废弃物生物处置及提高厌氧消化产甲烷方面具有极大的应用潜力。