益母缩宫颗粒对药物不全流产大鼠子宫匀浆NO、NOS的影响

吴 敏，何青兰，李虹秀，李品英，黄正迎，杨 婷，毛 惠

（1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；3.乐山市中医医院，四川 乐山 614000）

全世界每年大约有8500万例非意愿妊娠，其中50%以流产告终[1]。近年来，由于米非司酮联联合索前列醇终止早孕具有成功率高、使用方便、经济的特点而成为药物流产的常用方法。但药流后常有药流不完全而导致阴道流血时间长和阴道流血量多的并发症。我院院内制剂益母缩宫颗粒由《傅青主女科》生化汤化裁而来，由益母草、川芎、枳壳、当归、炮姜、桃仁、生蒲黄组成，具有活血化瘀、促进宫缩的作用，前期研究证实其能有效减少药物流产后阴道流血时间，有促进恶露排出及辅助子宫复旧的作用[2][3]，但其对药物流产后子宫的作用机制尚未完全明确，本实验按照王晓东[4]所述实验方法造成药物不全流产大鼠模型，检测大鼠子宫匀浆中NO含量及NOS活力寻找本药对于模型大鼠子宫可能的作用机制，为该药的临床应用提供依据，也为本药的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级别SD大鼠，雌性60只，雄性30只，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号 SCXK（川）2015-030。雌性大鼠体重210～240 g，雄性大鼠体重250～280 g，饲养于西南医科大学实验动物中心，许可证号SYXK（川）2018-065。

1.2 实验药物

益母缩宫颗粒，10 g/袋，西南医科大学附属中医医院，批号20181005，大鼠给药量为低剂量组3.125 g/（kg.d），中剂量组6.25 g/（kg.d），高剂量组12.5 g/（kg.d）。

新生化颗粒，9 g/袋，江苏仁寿药业有限公司，批号181211，大鼠服药剂量为2.813 g/（kg.d）。

米非司酮，内含米非司酮25 mg/片，华润紫竹药业有限公司，批号431904011，大鼠给药量为8.3 mg/kg。

米索前列醇，内含米索前列醇0.2 mg/片，华润紫竹药业有限公司，批号43190302，大鼠灌胃量为0.1 mg/kg。

水合氯醛，100 g/瓶，天津大茂化学试剂厂，批号20181201，使用时用生理盐水配制成10% 溶液。

所有灌胃药物均根据人鼠剂量比换算成大鼠灌胃剂量，成人体重按60 kg计算。

1.3 实验所需试剂及仪器

实验试剂：总蛋白（TP）测试盒，A045-2-1；一氧化氮（NO）测试盒，A012-1-2；总一氧化氮合成酶（NOS）测试盒，A014-2-2，均由南京建成生物工程研究所提供。

实验仪器：恒温电子水浴锅，型号DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司；酶标仪，型号SpectraMAX Plus384，美谷分子仪器有限公司；722可见分光光度计，UV752N紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；优普超纯水制造系统，型号UPH-Ⅱ-10T，成都超纯科技有限公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，型号SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂。

2 实验方法

2.1 造模

按照王晓东[4]所述实验方法造模，将雌雄大鼠于每日下午18：00按2：1合笼，次晨08：00检查雌鼠阴道，查见阴栓或者阴道分泌物涂片于镜下查见精子则视为该雌鼠受孕d1，未受孕雌鼠于下午18：00继续合笼，连续合笼一周。

将受孕雌鼠取8只作为空白组分笼喂养，其余受孕雌鼠受孕d7统一造模，受孕d7日晨08：00灌胃米非司酮混悬液0.83 mg/ml，下午18：00灌胃米索前列醇混悬液0.01 mg/ml，空白组大鼠灌胃动物实验中心饮用水，灌胃浓度均为1 ml/100g。灌胃米索前列醇后于雌鼠阴道内置入定量棉球1枚，次晨检查大鼠阴道内棉球，查见血迹认定为造模成功。将造模成功大鼠分为益母缩宫颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组及新生化颗粒组。

各组大鼠均于受孕d8灌胃药物，实验组分别灌胃高、中、低浓度益母缩宫颗粒，对照组灌胃新生化颗粒，模型组及空白组大鼠灌服动物实验中心饮用水。连续灌胃7天，每天1次。

2.2 动物标本的采集

各组大鼠于开始灌胃第8天用水合氯醛按0.35 ml/100 g剂量腹腔注射麻醉大鼠，麻妥后将大鼠固定于台上，腹部正中行纵切口，逐层开腹，钝性分离周围组织，找到子宫，用眼科剪分离子宫，下自宫颈口，上自子宫末端，离断子宫，置于天平上进行称重，称重后将子宫组织置于-80℃冰箱里保存以备制备组织匀浆。

2.3 子宫匀浆中NO含量及NOS活力的检测方法

取出子宫组织，梯度温度解冻，称取组织块0.1 g～0.2 g在冰生理盐水中漂洗除去多余血液及杂质，用滤纸拭干组织，称重，然后放入5 mL的EP管内。量取0.9%生理盐水，按组织质量与生理盐水体积m：v比为1：9的比例加入生理盐水，然后剪碎组织，用匀浆机研磨，制成10%组织匀浆。将制备好的组织匀浆用离心机以3500 r/min转速离心10分钟，然后留取上清液以备检测。按硝酸酶还原法检测上清液中NO含量及NOS活力，按照指示盒说明进行操作。

2.4 统计分析

实验数据资料用SPSS 23.0进行分析，所有资料均为计量资料，数据分布呈正态分布且方差齐，用“±s”表示，统计方法使用用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较用LSD-t法进行分析。P＜0.05则认为差异具备统计学意义。

3 实验结果

表1 益母缩宫颗粒对药物不全流产大鼠子宫匀浆NO含量及NOS活力的影响（±s）

表1 益母缩宫颗粒对药物不全流产大鼠子宫匀浆NO含量及NOS活力的影响（±s）

备注：与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与新生化颗粒组相比，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

组别 N/只 NO含量（MMOL/GPROT） NOS活力（U/MGPROT）模型组 8 12.698±2.463▲ 1.210±0.142新生化颗粒组 9 9.781±2.786# 1.116±0.177低剂量组 8 13.227±2.271▲▲ 1.231±0.182中剂量组 9 10.956±2.899 1.285±0.234▲高剂量组 9 9.961±2.076# 1.057±0.117

与模型组相比，益母缩宫颗粒高剂量组及新生化颗粒组子宫匀浆中NO含量降低，差异显著（P＜0.05），益母缩宫颗粒中剂量组子宫匀浆中NO含量有降低趋势，差异无统计学意义（P＞0.05）；与新生化颗粒组相比，益母缩宫颗粒低剂量组子宫匀浆中NO含量有所升高，差异显著（P＜0.01），余组间未见统计学差异。

与模型组相比，益母缩宫颗粒高剂量组和新生化颗粒组NOS活力有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与新生化颗粒组相比，益母缩宫颗粒中剂量组NOS活力升高，差异显著（P＜0.05）。

证实新生化颗粒和高剂量益母缩宫颗粒均能减少模型大鼠子宫匀浆中NO含量，对NOS活力无显著影响，且益母缩宫颗粒对模型大鼠NO含量呈一定的剂量依赖效应。

4 讨 论

NO是一类能使平滑肌组织及血管舒张的气体分子，NO生成后能立即扩散到周围的平滑肌细胞中，与sGC结合并激活sGC，在Mg2+的作用下升高平滑肌细胞的cGMP水平，使细胞内Ca2+浓度下降，从而导致平滑肌松弛、血管扩张[5]。NOS是合成NO必须的物质，同时也是NO合成的限速因子[6]。NO对也子宫平滑肌的舒张起重要作用，NO含量降低，可通过促进子宫平滑肌收缩，起到止血的作用[7]。本实验证实高剂量益母缩宫颗粒可降低模型大鼠子宫匀浆中NO含量，可能通过此途径对模型大鼠子宫平滑肌起到收缩的作用。

分析各药物的作用，方中益母草、蒲黄、桃仁、枳壳对于子宫平滑肌均表现出正性肌力作用。现代药理研究表明，益母草的生物碱和酚酸类化合物有增强大鼠子宫平滑肌收缩的作用[8]，当归具有抑制和促进子宫收缩两种作用[9]；川芎提取液可抑制离体子宫平滑肌的收缩[10]；蒲黄对离体子宫及在体子宫均表现为促进子宫平滑肌兴奋作用[11]；桃仁醇提取物能增强豚鼠子宫的收缩作用；枳壳对家兔子宫表现为兴奋作用，使子宫收缩力及紧张度增加。它们共同作用于子宫平滑肌组织，起到促进模型大鼠子宫收缩的作用。

前期研究证实[3]，益母缩宫颗粒能有效减少药物不全流产大鼠阴道出血时间及出血量。本实验进一步证实，益母缩宫颗粒可通过减少模型大鼠子宫匀浆中NO含量，起到促进子宫收缩的作用，可能通过此途径起到减少模型大鼠的阴道出血时间及出血量的作用。但益母缩宫颗粒对药物不全流产大鼠的作用机制仍需进行进一步深入探索。