生物样本库保存肺组织制作冷冻切片的体会

王灿铭,苏 丹，, 应莉莎,黄旻然, 吴映雪,胡锦林

随着生物样本库的建立和科研需求，生物样本库中保存的肺组织不仅需要进行核酸的提取，还需行HE染片。现将从生物样本库中保存的肺组织冷冻切片与常规术中肺组织冷冻切片的制作不同注意事项汇报如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集浙江省肿瘤医院生物样本库肺癌标本90例，每例包括正常肺组织4块，癌旁组织4块，癌组织4块。

1.2 材料英国产Thermo FSE型冷冻切片机。DEPC原液、甲醇、Gill改良苏木精染液、醇溶性伊红、梯度乙醇和二甲苯等。

1.3 方法(1)冷冻切片机彻底化霜，清洗干净后擦DEPC原液，去除RNA对样本的影响；(2)冷冻切片机箱体温度设置-30 ℃，制作时速冻台设置-50 ℃；(3)一次性切片刀在DEPC液中浸泡10 min后晾干，使用前用无水乙醇擦拭，每切一个样本换一把新刀；(4)生物样本库取出样本后放入干冰中保存，切片时直接从干冰中拿取；(5)将适量OCT包埋剂涂在冷冻样本托上，稍冷凝后，将样本包埋好，样本托放置于速冻台上，压上冷冻锤至组织完全冷冻；(6)正常肺组织、癌旁组织切片厚6 μm，癌组织切片厚5 μm，匀速切片后入甲醇固定1 min；(7)进行规范HE染色，封固；(8)组织去除OCT包埋剂后放入RNA保存液中低温保存。

2 结果

通过该方法制作的冷冻切片，生物样本库提取的正常肺组织、癌旁组织细胞核清晰，癌组织结构清晰完整，颜色鲜艳(图1、2)。

①②

图1正常肺组织：组织结构清晰，核质染色鲜艳，对比度好
图2肺癌组织：组织结构清晰，核质染色鲜艳，对比度好

3 讨论

生物样本库中肺癌组织制作冷冻切片后，剩余组织还需进行RNA的提取，这就要求每一例标本均不能被污染。在制作的前一天，要对冷冻切片机进行彻底化霜，清洗干净后擦DEPC原液，去除其他RNA对样本的影响。一次性切片刀不能用高温消毒，以免高温破坏刀锋而导致无法顺利切片，可以在DEPC液中浸泡10 min后晾干，用无水乙醇擦拭后使用。对样本托和镊子等工具，每使用一次均需用无水乙醇擦拭。

与日常冷冻切片箱体温度设置在-20 ℃不同[1]，从生物样本库保存的肺组织制作冷冻切片时的箱体温度应尽可能的低一些，设置约-30 ℃，速冻台设置-50 ℃。由于肺组织的结构比较疏松，血供丰富，腔隙较多，部分组织有较多的坏死和炎性分泌物，冷冻时间不能太久，否则易产生假象[2]。正常肺组织有大量的肺泡，切片时组织的支撑力不够，温度太高切片易产生皱褶，很难平整地切出。本组实验中发现，连续切片2 h冷冻切片机的箱体温度随着切片时间的加长而上升，当箱体温度为-20 ℃时，切片会吸附在切片刀座或防卷板上，很难平整地展片。这是由于肺组织从样本库提取后，在干冰中存放，样本温度接近-80 ℃，在切片时样本的温度也较低，样本与切片刀座或防卷板的温差较大，极易吸附。切片时除了手摇轮用力均匀，进刀速度需迅速，避免切片因样本支撑力度不足和温差的影响而粘连。

样本库提取的组织较小，OCT包埋剂应适量，用量太少切片时组织的支撑力不够，不能很平整的出片；太多增加冷冻时间，切片时组织周边会粘连，易出现皱折。调整防卷板至合适的位置尤为重要，防止切片卷曲和皱折。常规冷冻切片中常伴有冰晶存在，而减少冰晶的关键是速冻。由于细胞内多数水分子以水化物的形式结合在蛋白质或其他大分子的极性区域，部分水分子呈游离状态，缓慢的冷冻使水分子向细胞间疏松区域游离、聚集，然后凝结成冰，等切片快速放入固定液后，冰融化留下空洞[3]。肺癌组织样本在遭受多次冷冻/解冻循环后，对提取的RNA质量和随后的RT-PCR分析产生不利影响[4]，同时也会增加冰晶的产生，尽量一次性冷冻到位。本组制作的冷冻切片出现冰晶的情况极少，这主要是样本在入库时的温度极低，达到速冻的条件，切片经包埋后又在-50 ℃的速冻台上速冻，快速越过产生冰晶的温度，切片质量明显提高。

总之，从生物样本库保存的肺组织制作科研用冷冻切片时，我们在熟练操作的同时，需注意以下几点：(1)准备工作要做足，特别是冷冻切片的清洗与消毒，保证样本不能被污染；(2)尽可能地增强组织的支撑力；(3)冷冻切片机的温度要比常规冷冻切片时更低些，避免因温差太大而切片吸附在防卷板或切片刀座上；(4)组织从干冰中提取后及时包埋冷冻，组织化开后再次冷冻易产生冰晶及对RNA质量的影响。只要我们按流程操作，掌握原理，不断摸索、总结，通过各种方法提升自己的专业知识和操作水平，并灵活正确的运用到实际工作中，一定能制作出高质量的冷冻切片。