结直肠癌组织中APC、β-catenin和COX-2的表达及临床意义

顾冬梅，覃玲艳，干文娟，虞 杰，尤志群，郭凌川，王修珍

结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前结直肠癌占全球癌症发病率的第4位，病死率的第2位[2]。相关研究[3]表明结直肠癌发生与Wnt信号通路的异常调节有关。结肠腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)是Wnt信号通路的成员之一，其突变与结直肠癌的发生密切相关[4]。β-catenin即β-连接蛋白，是Wnt信号通路的关键分子，其在结直肠癌的发病机制中起重要作用。COX-2是一种可诱导的前列腺素合成酶(prostaglandin G/H synthase, PTGS)，是Wnt信号通路的下游靶基因[5]。本实验应用组织芯片联合全自动免疫组化EnVision两步法检测Wnt信号通路成员APC、β-catenin和COX-2在结直肠癌组织和癌旁正常结直肠组织中的表达，分析三者表达与结直肠癌临床病理特征的关系，探讨其在结直肠癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料收集苏州大学附属第一医院2011年1月～2015年12月存档的112例结直肠癌手术切除标本，其中结肠癌59例，直肠癌53例；男性59例，女性53例；患者年龄31～91岁，平均61.86岁；肿瘤直径≤5 cm者81例，>5 cm者31例；依据WHO(2010)消化系统肿瘤分类标准[6]对各病例进行分类：高分化2例，中分化97例，低分化13例；有淋巴结转移66例，无淋巴结转移46例，伴远处脏器转移10例；未侵及浆膜层36例、侵及浆膜层76例；Ⅰ+Ⅱ期44例，Ⅲ+Ⅳ期68例。患者术前均未进行放、化疗等治疗。另选取对应的距离癌组织2 cm的癌旁正常结直肠组织作为对照。所有组织均经10%中性福尔马林固定，常规脱水浸蜡，石蜡包埋。

1.2 方法选取所需病例组织蜡块，制作组织芯片阵列(图1)，3 μm厚连续切片，采用免疫组化EnVision两步法染色。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，用PBS替代一抗做阴性对照。兔抗人APC多克隆抗体，兔抗人COX-2单克隆抗体，均购自北京中杉金桥公司；鼠抗人β-catenin单克隆抗体购自上海基因公司；免疫组化EnVision试剂盒及其他试剂均购自美国罗氏公司。

AB

图1结直肠癌组织(A)和正常结直肠组织(B)的组织芯片蜡块

1.3 判读标准APC和COX-2阳性定位于细胞质或细胞膜，呈棕黄色颗粒状。按阳性细胞百分比评分：≤4%为0分，5%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，75%～100%为4分。按细胞染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分结果相乘：0分为(-)，1～2分为(+)，3～4分为()，5分以上为()，其中≥3分为阳性[7]。β-catenin阳性呈棕黄色细小颗粒状，以细胞膜染色阳性且阳性细胞数≥70%为正常表达，细胞质和(或)细胞核染色阳性且细胞数≥10%为异位表达。出现细胞膜表达减弱或缺失以及异位表达均视为异常表达[8]。

1.4 统计学分析应用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。表达的差异性采用χ2检验、校正χ2检验；相关性采用Spearman秩相关检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和正常结直肠组织中APC、β-catenin和COX-2的表达APC在结直肠癌组织和癌旁正常结直肠组织中的阳性率分别为40.2%(45/112)、93.8%(105/112)(图2)。β-catenin在正常结直肠组织中的表达主要定位于细胞膜，在结直肠癌组织中的表达主要定位于细胞质和(或)细胞核。β-catenin在结直肠癌组织和癌旁正常结直肠组织中的阳性率分别为72.3%(81/112)、10.7%(12/112)(图3、4)；COX-2在结直肠癌组织和癌旁正常结直肠组织中的阳性率分别76.8%(86/112)、11.6%(13/112)(图5)，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

②③④⑤

图2APC在正常结直肠组织中呈细胞质阳性，EnVision两步法

图3β-catenin在结直肠癌组织中的异位表达，呈细胞质阳性，EnVision两步法图4β-catenin在结直肠癌组织中的异位表达，呈细胞核阳性，EnVision两步法图5COX-2在结直肠癌组织中呈细胞质和细胞膜阳性，EnVision两步法

2.2 结直肠癌中APC、β-catenin和COX-2表达与临床病理特征的关系APC蛋白表达与肿瘤分化程度相关(P<0.05)；与患者年龄、性别、肿瘤大小、位置、肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、临床分期均无关(P>0.05，表2)。β-catenin和COX-2蛋白表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期相关(P<0.05)；与患者性别、年龄、肿瘤大小、位置均无关(P>0.05，表2)。

2.3 结直肠癌组织中APC、β-catenin和COX-2表达的相关性在结直肠癌组织中，APC表达与β-catenin的异常表达、COX-2的表达呈负相关(rs=-0.551，P<0.01；rs=-0.542，P<0.01)；β-catenin的异常表达与COX-2的表达呈正相关(rs=0.558，P<0.01，表3)。

3 讨论

结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率逐年呈递增趋势，预计2030年全球发展中国家结直肠癌的发病率高达60%[9]。肿瘤的发生、发展是受多因素影响的复杂过程，Wnt信号通路上一些关键因子的调控与结直肠癌的发生密切相关。

APC是一种亲水性胞质蛋白，定位于结直肠黏膜上皮细胞的基膜。临床研究发现，约70%的结直肠癌存在APC基因缺失或突变[10]。正常的APC蛋白与Axin和β-catenin相结合，并通过GSK-3β促进β-catenin磷酸化[11]，激活Wnt信号通路，促进细胞大量增殖、分化，诱发癌变。本组实验中APC在结直肠癌组织中的阳性率为40.2%(45/112)低于正常结直肠组织(93.8%，105/112)，且APC蛋白在结直肠癌高+中分化组中的表达显著高于低分化组(P<0.05)，这与Nelson等[12]对APC蛋白功能的研究结果一致，提示APC蛋白失表达在结直肠癌的发生、发展中起重要作用。

β-catenin蛋白主要定位于细胞膜。在细胞癌变过程中，游离的β-catenin积聚于细胞质，并随浓度上升进入细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，促进下游靶基因的激活与异常转录[13]。在本组癌旁正常结直肠组织中，β-catenin主要表达于细胞膜，在结直肠癌中，β-catenin主要异常表达于细胞质和(或)细胞核。β-catenin在结直肠癌组织中的异常表达率为72.3%(81/112)，远高于正常结直肠组织。提示β-catenin在肿瘤细胞中有按胞膜→胞质→胞核方向流动的趋势，这与Peker等[14]的研究结果相符。本组实验结果显示，在结直肠癌组织中，β-catenin的表达与肿瘤分化程度呈负相关，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈正相关(P<0.05)，提示β-catenin的异常表达对结直肠癌的分化、侵袭及转移有重要影响。

表1 结直肠癌组织和癌旁正常结直肠组织中APC、β-catenin和COX-2的表达

表2 结直肠癌中APC、β-catenin和COX-2的表达与临床病理特征的关系

表3 结直肠癌组织中APC、β-catenin和COX-2表达的相关性

COX-2即诱导型环氧化酶，在机体受各种炎症介质、激素及促瘤因素等的刺激作用下高表达[15]，是Wnt通路的靶基因。本组实验结果显示，COX-2在结直肠癌组织中高表达(76.8%，86/112)与Mahmoud等[16]的研究结果一致。相关研究表明，COX-2过表达可抑制E-cadherin的功能，使肿瘤细胞黏附性降低，促使肿瘤局部浸润和远处转移。本组实验结果显示，在结直肠癌组织中，COX-2表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。提示COX-2有可能成为判断结直肠癌生物学行为及评估预后的重要标志物。

在Wnt信号通路中，APC的突变或缺失可导致β-catenin大量聚集进入细胞核内与TCF/LEF1转录因子结合，激活下游靶基因。COX-2含有TCF结合位点，是β-catenin通路的下游靶基因，β-catenin的异常表达可上调COX-2的表达[5]。本组实验结果表明，在结直肠癌组织中APC的表达与β-catenin的异常表达呈负相关(rs=-0.551)，β-catenin的异常表达与COX-2的表达呈正相关(rs=0.558)，提示APC蛋白失活是β-catenin异常表达的诱因，β-catenin异常聚集可通过增加COX-2的过表达促进肿瘤的演变。由此认为APC突变→引起β-catenin积聚→β-catenin与转录因子TCF/LEF1结合→激活COX-2→致癌，因此APC功能缺失导致COX-2转录作用失控，从而诱发癌变。

综上所述，本实验应用组织芯片联合全自动免疫组化EnVision两步法检测APC、β-catenin和COX-2在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征的关系，表明三者通过Wnt信号通路共同参与结直肠癌的发生、发展过程，促进肿瘤的演变。因此单独或联合检测APC、β-catenin和COX-2的表达，有助于提高结直肠癌的临床诊断、评估预后和研发抗肿瘤药物的新靶点。