基于单克隆抗体的O 型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA 检测方法的建立

许智强，李敏杰，刘彦玲，周国辉，于 力

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 牛羊传染病研究创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由FMD病毒（FMDV）感染引起的偶蹄动物（牛、羊、猪等）的急性、热性和可快速远距离传播的一类传染病[1]，世界动物卫生组织（OIE）和联合国粮农组织（FAO）将其列为A 类烈性传染病之一。FMDV 现有A、O、C 型（欧洲型）、SAT1、SAT2、SAT3（非洲型）和Asia1 型（亚洲型）等7 个血清型[2]和众多的拓扑型，其中，O型和A 型在我国流行最为广泛[3-4]。在现今国际贸易日趋繁荣、物资交流和旅游活动日益便捷的情况下，许多国家都有可能再度遭到FMD 的袭击[5]。大多数国家通过检测针对FMDV 结构蛋白的抗体水平评价FMD 疫苗的免疫效力、指导FMD 疫苗的免疫接种计划、用于国际贸易和血清流行病学调查和非免疫地区的疫情监测，并依此实行FMD 的免疫清除计划。

检测FMDV 抗体的经典方法为病毒中和试验（VNT），该方法准确可靠，但需要动用活的病毒，因此只能在专业的实验室进行，且工作量大、耗时长，不能进行高通量的检测。近年来出现了液相阻断ELISA 方法（LPBE），该方法使用灭活的病毒作为抗原，避免了散毒的危险，而且灵敏性高，重复性更好、检测速度更快，尤其适合于大批量血清样品的检测。但LPBE 方法也存在不足之处，在不同动物群体可产生不同比率的假阳性率，且该方法的稳定性还受捕获多抗和检测多抗相关试剂不同批次的影响。固相竞争ELISA（The solid-phase competition ELISA，SPCE）除了具有LPBE的优点外，特异性明显提升、操作更为简便、结果更稳定、重复性更高[1]，2004 年被世界动物卫生组织（OIE）确立为国际贸易中FMD 血清学检测的一种指定方法。

传统的SPCE 以多克隆抗体作为检测试剂的组分，其制备繁琐、成本高、批次之间变异性大难于标准化，可能存在一定的交叉反应。使用单克隆抗体（MAb）可提升检测试剂的特异性和批间稳定性，且易于标准化、制备成本下降。基于以上的考虑，本研究将针对O 型FMDV 保守表位的MAb 与SPCE 方法相结合，建立了新型的基于MAb 的SPCE 方法，用于FMDV抗体的定量检测。该方法可用于评价FMD疫苗的免疫效力，指导FMD疫苗的免疫接种计划。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 MAb 3D9[6]（浓度3.47 mg/mL）和8E8[7]（浓度2.97 mg/mL）由本实验室制备并保存；灭活的O 型FMDV 抗原由中牧实业股份有限公司提供；乳仓鼠肾细胞（BHK-21）由本实验室保存；经VNT 检测为阴性的血清290 份，包括牛血清140份、猪血清150 份，采自未注射疫苗的未发生FMD的动物；经VNT 检测为O 型FMDV 抗体阳性血清230 份，包括牛血清110 份、猪血清120 份，为FMD 灭活疫苗免疫动物血清；未经检测血清510份，包括羊血清120 份、牛血清160 份、猪血清230份；健康雌性BALB/c小鼠购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；TMB 底物和辣根过氧化物酶（HRP）购自Sigma 公 司；O 型FMDV 抗 体 液 相 阻 断ELISA 检 测 试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；O 型FMDV ELISA 抗体检测诊断Jeno 试剂盒购自韩国金诺生物科技公司；酶标板购自Costar 公司；DEAE-Sephadex A-50 层析柱购自GE 公司；A 型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒（BCV）、牛轮状病毒（BRV）以及猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）、猪瘟病毒（CSFV）的标准阳性血清均由本实验室保存。

1.2 HRP 标记抗体 按文献[8]中的碘酸钠法标记纯化8E8 抗体。采用本实验室建立的直接ELISA 方法检测HRP 标记抗体的抗体效价。

1.3 SPCE 反应条件的优化 选取10 份经VNT 检测为O 型FMDV 抗体阳性的血清（包括4 份牛血清和6 份猪血清）和10 份经VNT 检测为阴性的血清（包括4 份牛血清和6 份猪血清）作为待检血清。采用MAb 3D9 作为捕获抗体，以O 型FMDV 病毒粒子作为抗原，HRP-8E8 作为检测MAb，将检测MAb 与待检血清同时加入ELISA 板中，反应后采用TMB 显色液进行显色。采用方阵方法，优化各反应条件：MAb 3D9包被浓度（1∶1 000、1∶2 000、1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000）、抗原浓度（1∶1、1∶2、1∶3）、抗原孵育时间（1 h、2 h）、检测MAb 8E8 稀释度（1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000）、检测MAb与待检血清孵育时间（1 h、2 h）、显色液显色时间（10 min、15 min、20 min），初步建立检测血清中O型FMDV 抗体的SPCE 方法。

1.4 阴性和阳性临界值的判定 利用本研究建立的SPCE 方法检测289 份阴性血清和227 份阳性血清。以抑制百分率PI 作为结果判定依据，参照结果判定标准对检测血清进行定性评价。

2 结 果

2.1 HRP-8E8 的效价测定结果 通过直接ELISA方法对HRP-8E8 进行效价测定，在1∶4 000 稀释时OD450nm接近1.0，从而确定HRP-8E8的效价为1∶4 000。

2.2 SPCE 各组分工作浓度的确定 经方阵滴定法确定该SPCE 方法的最优反应条件见表1。

表1 SPCE 最佳工作浓度的确定Table 1 Determination of the optimal working concentration of SPCE

1.5 特异性试验 利用本研究建立的SPCE 分别检测A 型FMDV 抗体阳性参考血清以及BCV、BRV、PRRSV、PCV 及CSFV 的标准阳性血清，并以1 份经VNT 检测为O 型FMDV 抗体阳性的猪血清作为对照，检测该方法特异性。

1.6 敏感性试验 将1 份经VNT 检测为O 型FMDV抗体阳性的猪血清，以1∶4 为起始稀释倍数经2 倍倍比稀释（1∶4～1∶1 024）后，利用本研究建立的SPCE 方法、LPBE 和VNT 分别进行检测，检测该方法的敏感性。

1.7 重复性试验 利用同一批次制备的ELISA 板，选取6 份待检血清在3 个不同的时间点检测，试验重复3 次，评价该方法的批内重复性；利用3 个批次包被的ELISA 板，选取6 份待检血清进行检测，试验重复3 次，评价该方法的批间重复性。

1.8 SPCE 与LPBE、VNT 检测结果的相关性比较从510 份未经检测血清中随机选择108 份血清，包括羊血清15 份、猪血清51 份、牛血清42 份，分别利用SPCE、LPBE 和VNT 检测抗体滴度，比较检测结果相关性。

1.9 SPCE 方法的临床应用 采用本研究建立的SPCE 方法和韩国Jeno 试剂盒分别对120 份羊血清、160 份牛血清、230 份猪血清进行检测，比较检测结果。

2.3 SPCE 临界值的确定 PI 统计结果表明，最佳区分阴阳性血清的稀释度为1∶32，阴阳性血清在此稀释度无交叉。所有阴性血清的PI 值均小于45%，而所有阳性血清的PI 值均高于45%。因此，当血清1∶32 稀释时，将SPCE 检测的PI 临界值确定为45%（图1）。

图1 O 型FMDV 抗体SPCE 检测阴性血清和阳性血清的百分抑制率（PI 值）分布图Fig.1 Frequency distribution of the percentage inhibitions recorded from detection of positive and negative sera detected by the type O FMDV antibody SPCE

2.4 特异性试验结果 用O 型FMDV 抗体SPCE 分别检测A 型FMDV 抗体阳性参考血清及BCV、BRV、PRRSV、PCV、CSFV 的标准阳性血清。检测结果均为阴性，未出现交叉反应（表2）。表明该方法特异性良好。

2.5 敏感性试验结果 取1份经VNT检测为O型FMDV抗体阳性的猪血清样品2 倍倍比稀释后，经本研究建立的SPCE 方法检测，评估该方法的敏感性。结果显示，ELISA 检测OD450nm值与VNT 测定的效价呈正相关，随着阳性血清稀释倍数增加，其OD450nm值平缓递减。当阳性血清稀释至1∶512 时，检测得到的PI 值仍大于45，而稀释到1∶1 024 时，PI 值小于45，判为阴性。所以该方法的敏感性为1∶512，表明该方法的敏感性较高。LPBE 的敏感性为1∶1 024，VNT 的敏感性为1∶256（图2，表3），表明SPCE 的敏感性相比LPBE 与VNT 更为接近。

表2 特异性试验结果Table 2 Specificity test results

图2 敏感性试验结果Fig.2 Sensitivity experiment of the SPCE(A)and the LPBE(B)

表3 VNT 敏感性试验结果Table 3 Sensitivity experiment of the VNT

2.6 重复性试验结果 利用同一批次制备的ELISA板，检测随机抽取的6 份血清，结果显示批内变异系数低于10%；利用不同批次制备的ELISA 板检测随机抽取的6 份血清，结果显示批间变异系数低于10%（表4）。表明该方法重复性良好。

2.7 SPCE 与LPBE、VNT 检测结果的相关性比较比较SPCE、LPBE 和VNT 的检测结果，其中SPCE 与LPBE 的相关系数为0.896（图3A），与VNT 的相关系数为0.923（图3B），均属于高度相关。且该方法与VNT 相关性更高，表明该方法检测结果具有良好的可靠性。

表4 重复性实验结果（n=6）Table 4 Reproducibility test results of SPCE(n=6)

图3 SPCE 与LPBE（A）、VNT（B）检测抗体的相关性及回归方程Fig.3 Scatter plots and calculated regression lines for LPBE(A),VNT(B)and SPCE

2.8 SPCE 的临床应用 检测羊血清120 份，本研究建立的SPCE 方法与Jeno 试剂盒总体符合率为91.4%，其中阳性符合率为91%，阴性符合率为84.3%。检测牛血清160 份，本研究建立的SPCE 方法与Jeno 试剂盒总体符合率为89%，阳性符合率为89.5%，阴性符合率为88%。检测猪血清230 份，其中总体符合率为90%，阳性符合率为91%，阴性符合率为89%。结果表明该SPCE 方法检测结果较为准确，可用于O 型FMDV 血清抗体的检测。

3 讨 论

血清学检测技术是FMD 防治的重要技术，在FMD 暴发和流行时结合其它方法可对疫情进行预测和判断，而且能对FMD 疫苗的免疫效力进行评估。目前，我国主要使用LPBE 试剂盒检测抗体对FMD疫苗的免疫效力进行评估。OIE 推荐的3 种检测FMDV 抗体的方法为：VNT、LPBE 和SPCE。VNT 是经典的抗体检测方法，是评价其它方法的金标准。本研究在国际上采用的多克隆抗体SPCE 方法的基础上，建立了基于MAb 的SPCE 方法。同使用多克隆抗体血清相比，MAb 用作检测试剂有特异性好、批次之间稳定、易于标准化生产等优点。

本研究中使用的包被MAb 3D9，具有与7 个血清型FMDV 结合的能力和很强的抗原捕获能力[6]。本研究中使用的检测MAb 8E8，能够与O 型FMDV各基因型的所有病毒株结合，是O 型广谱且具有强中和活性的MAb[7]。利用有中和活性的MAb 建立SPCE 方法，可以增强方法的特异性。且检测结果与VNT 的相关性更高，可以更好地反映出疫苗的免疫效果。该ELISA 方法的术式中，将检测MAb 和待检血清同时加入ELISA 板中，只需1 h 反应时间，而LPBE 方法一般需要4.5 h 的反应时间，相比之下本研究构建的SPCE 步骤简单能节省许多时间。

批内和批间重复性试验结果表明，建立的方法精密度较高。这可能与该方法使用了MAb，质量稳定有关。且该方法采用SPCE 的术式，增强了方法的稳定性。

本研究对3 种抗体检测方法的相关性进行了比较研究。分别用SPCE、LPBE 和VNT 测定了108 份血清的抗体滴度，SPCE 与LPBE 的相关系数是0.896、与VNT 的相关系数是0.923。可见SPCE 与VNT 具有高度的相关性。在检测中发现，有些疫苗免疫血清，用LPBE 可检测出较高的抗体滴度，而使用SPCE 和VNT 只能检测出较低的抗体滴度。这可能是由于疫苗免疫之后诱导机体产生了一部分无中和活性的抗体，而本研究建立的SPCE 和VNT 方法检出的是中和活性有关的抗体。这可能也从另一个方面说明了LPBE 特异性较低的原因。

本研究以3D9 作为包被MAb、8E8 作为检测MAb，建立了O 型FMDV 抗体SPCE 检测方法，并进行了临床应用。该方法的特异性和敏感性良好，与VNT 和LPBE 的相关性和符合率均较高，批内和批间差异性小，为国内O 型FMDV 抗体的检测建立了一种新的方法。