生物可降解Dex-APBA-IBU偶联物的合成和表征

高亚钗

(天津工业大学 材料科学与工程学院，天津 300387)

聚合物-药物偶联物(polymer-drug conjugate，PDC)是药物递送领域研究的趋势，几种偶联物已成功地转化为临床实践。它的原理是将治疗药物与聚合物(例如聚乙二醇)共价缀合，而不是采用常规纳米疗法将治疗药物包埋在聚合物纳米载体中，这种新型的纳米治疗方法能克服传统给药方式引发的一些缺陷，包括能改善治疗药物的溶解性，延长治疗药物体内的循环时间，降低的免疫原性，控制药物释放和增强的安全性等[1-3]。

葡聚糖为细菌性多糖之一，又称右旋糖酐，它兼具生物相容性和良好的水溶性，且无毒，因此经常被用作药物纳米载体。最重要的是葡聚糖主链上有大量的羟基，这样的结构不仅使得葡聚糖有良好的水溶性，而且羟基结构有利于对葡聚糖进行化学修饰[4]。布洛芬是一种非甾体类抗炎药，它主要作用是抑制环氧化酶，产生镇痛、抗炎作用，但是它的缺点是水溶性较差，体内生物利用度低，这些缺点严重限制了布洛芬作为抗炎药的作用及应用[5-6]。因此将布洛芬与葡聚糖连接成葡聚糖-布洛芬偶联物，将两亲性偶联物组装成纳米粒子，不仅能改善药物的水溶性，增强的稳定性，延长的血浆半衰期，还具有有效的细胞内递送的潜力。

1 实验

1.1 实验药品与仪器

布洛芬(IBU)，纯度≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司；3-氨基苯硼酸(APBA)，纯度≥99%，天津希恩思生化科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，纯度≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，纯度≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖(Dex，Mw=5000)，纯度≥98%，阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钠(NaOH)，纯度≥98%；天津市风船化学试剂科技有限公司。

FD-1A-50真空冷冻干燥机，天津比郎实验设备有限公司；LSP02-IB微流控注射泵，兰格恒流泵有限公司；AVANCE-400MHz核磁共振谱仪(NMR)，瑞士BRUKER公司；TENSOR 37傅立叶变换红外光谱仪，德国BRUKER公司；TU-19011紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。

1.2 IBU-APBA单体的制备

准备100 mL的圆底烧瓶，将布洛芬(2.5 mmol，0.515 g)加入10 mL无水DMSO中溶解其中。在避光条件下，然后将EDC(2.6 mmol，0.500 g)和NHS(2.6 mmol，0.300 g)溶于20 mL DMSO中，采用滴液漏斗逐滴滴加到上述布洛芬溶液中，在室温下避光活化2 h。之后在搅拌下同样采用滴液漏斗将APBA(5.0 mmol，0.685 g)滴加进上述反应物中，并在室温下反应4 h。反应完的产物在氢氧化钠溶液中沉淀，过滤得到乳白色的沉淀，将沉淀冷冻干燥获得乳白色的固体粉末，收率为72%。IBU-APBA单体的制备路线如图1。

图1 IBU-APBA单体的制备路线图

1.3 两亲性Dex-APBA-IBU 偶联物的制备

准备50 mL的圆底烧瓶，将IBU-APBA(0.50 mmol，0.17 g)和葡聚糖(0.05 mmol，0.25 g)加入其中，并用10 mL无水DMSO溶解完全，将混合溶液在室温下搅拌8 h。将反应结束后的混合物在搅拌的情况下用冰乙醇沉淀，沉淀后过滤收获固体，将得到的固体用DMSO溶解后用冰乙醇沉淀，重复操作三次。将最终过滤的固体用DMSO溶解。将溶解后的溶液放入透析袋中(MWCO：10000 Da)用蒸馏水透析48 h，将所得溶液冷冻干燥以获得米色固体Dex-APBA-IBU，收率为62%。Dex-APBA-IBU偶联物的制备路线如图2。

图2 Dex-APBA-IBU偶联物的制备路线图

1.4 两亲性偶联物的自组装

载药IBU/OME NPs的合成：IBU/OME NPs是采用滴加法制得的。具体实验操作如下：将10 mg Dex-APBA-IBU 偶联物和5 mg 奥美拉唑完全溶解在2 mL DMSO中，然后搅拌条件下逐渐滴加到10 mL PBS缓冲溶液(pH值=7.4)。搅拌4 h后将该溶液采用蒸馏水透析(MWCO：10000Da)48 h除去DMSO，这样最终形成的溶液为Dex-APBA-IBU纳米粒子溶液。Dex-APBA-IBU偶联物的自组装示意图如图3。

图3 Dex-APBA-IBU偶联物的自组装示意图

1.5 载药NPs载药量的测定

1.5.1 胰岛素标准曲线的建立

奥美拉唑标准曲线的绘制：精确称取奥美拉唑5 mg，加入到25 mL容量瓶中，用DMSO定容，配制成浓度0.2 mg/mL的奥美拉唑储备液。再用DMSO稀释，分别配制一系列不同浓度奥美拉唑标准溶液。用紫外分光光度计在190～400 nm扫谱，确定最佳吸光度所对应的波长，以此波长的吸光度值A为纵坐标，以浓度X为横坐标，做图并进行线性拟合，得到奥美拉唑的标准曲线。

1.5.2 载药量的测定

采用紫外分光光度计测定载药纳米粒子载药量(DLC)，首先将包载奥美拉唑的纳米粒子溶液冷冻干燥并称量冻干样品的质量，将一定质量的冻干样品溶解在DMSO中，并在294 nm的紫外波长下检测溶液中奥美拉唑的吸光度，最后根据奥美拉唑标准曲线确定奥美拉唑载药纳米颗粒中奥美拉唑的含量，并进一步计算载药纳米颗粒的DLC。

公式1

2 结果与讨论

2.1 IBU-APBA单体的核磁(1H-NMR)表征

图4 IBU原料和IBU-APBA单体的1H-NMR对比图

在EDC和NHS的条件下，通过布洛芬(IBU)的羧基与3-氨基苯硼酸(APBA)的氨基之间的酰胺反应合成了IBU-APBA单体，如图4所示为 IBU-APBA的1H-NMR谱图，由谱图中1H-NMR (DMSO，δ in ppm)：化学位移δ=10.0 ppm (1)处出现的特征峰对应的是-CO-NH-的质子峰[7]，在δ=7.5-8.0 ppm处出现的一组峰(2)为APBA上的苯环峰[8]，δ=0.83(g)处的吸收峰为布洛芬上的甲基峰[9]。综上所述，我们的数据表明成功合成了IBU-APBA单体。

2.2 Dex-APBA-IBU偶联物的红外(FT-IR)表征

我们通过FT-IR对Dex-APBA-IBU PDC的结构进行表征。如图5为Dex-APBA-IBU的红外谱图，从图中Dextran的谱图可以看出，3410 cm-1处的吸收峰是Dextran上的-OH的伸缩振动吸收峰，1645 cm-1处的吸收峰是Dextran上-OH的弯曲振动吸收峰[10]。从Dex-APBA-IBU的谱图可以看出，1551 cm-1处为IBU-APBA上苯环的特征吸收峰，2956 cm-1处是IBU分子结构中的C-H伸缩振动吸收峰，2956 cm-1处是IBU分子结构中-CH3伸缩振动吸收峰。1330 cm-1处是形成的硼酯键的伸缩振动峰[11]。综上所述，我们的数据表明Dex-APBA-IBU偶联物被成功合成。

图5 Dex-APBA-IBU的FT-IR谱图

2.3 纳米粒子的载药量分析

图 6 奥美拉唑的紫外标准曲线

我们采用UV-Vis法测定了奥美拉唑(OME)在294nm处的标准曲线，图6是OME在DMSO中的紫外标准曲线。其中吸光度(A)和OME浓度(X，μg/mL)关系的线性回归方程如式1所示。

A=0.03739X-0.00724(R2=0.99945)(式1)

选用奥美拉唑作为模型药物制备了载药纳米粒子Dex-APBA-IBU(IBU/OME)，载药纳米粒子对OME的载药量通过上述所测的标准曲线进行定量分析，计算出纳米粒子中奥美拉唑的质量为1.48 mg，已知纳米载体的质量为10 mg，之后根据载药量公式1求得载药量为15%±2.0%。表明Dex-APBA-IBU纳米粒子有较好的载药性能。

3 结论

本研究合成了一种的Dex-APBA-IBU 偶联物，并通过1H-NMR和FT-IR验证了其化学结构。将质子泵抑制剂奥美拉唑(OME)包裹在Dex-APBA-IBU疏水内核中形成载药纳米粒子IBU/OME，其对OME的载药量分别为15.0%±2.0%，表明形成的偶联物纳米粒子对药物具有较高的包载能力，为纳米药物递送体系提供了新的思路。