响应面分析法优化罗望子多糖提取工艺

邵慧敏， 张 汇， 向雨维， 杨 柳， 宋子波， 艾连中

（1. 上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093；2. 云南猫哆哩集团有限责任公司，玉溪 653100）

罗望子（ Tamarindus indica L.） 是苏木科（Caesalpiniaceae）酸豆属（Tamarindus）的一种常绿大型乔木[1]，又称酸角、酸梅、酸豆、罗晃子、通血香等[2]，盛产于缅甸、孟加拉、印度、老挝等国[3]。罗望子果肉酸甜，可供食用，营养价值高。罗望子种仁含有质量分数为65%～73%非纤维碳水化合物、15%～20%蛋白质、6%～8%脂肪、3%～5%纤维和2.5%～3.2%灰分[4]。研究表明，从罗望子种仁中提取的罗望子多糖是一种中性多糖[5]，具有凝水、稳定、增稠、成膜、乳化等优良的理化性质[6-7]，且耐热、耐酸、耐碱、耐冻，是一种理想的食品添加剂。罗望子多糖分子结构为：主链是β-D-1,4 糖苷键连接的葡萄糖，侧链是α-D-1,6 糖苷键连接的木糖和β-D-1,2 糖苷键连接的半乳糖[8]；其分子量在720～880 kDa[9]。在我国海南、云南、广西、四川等地均有罗望子的栽培[10]，但其利用率极低，特别是对于罗望子多糖的开发利用。

目前，我国只有少数报道研究了关于罗望子多糖的提取及优化，如阚欢等[11]对料液比、pH 和沉降时间进行研究，将罗望子多糖的得率提高至52%；郇延军等[12]加入了酶解工艺，罗望子多糖的得率达到55%；而在王文光等[13]的研究中，优化后的多糖得率可达70.2%。以上研究均以提取物得率为应变量，并未验证其中多糖含量的高低，忽略了提取物中所含有的杂质，无法真正反映出罗望子多糖的提取率。另外，国家标准规定了罗望子多糖中蛋白质质量分数不得超过3%，但国内仍未有关于低蛋白罗望子多糖的研究。因此，本研究将综合罗望子多糖提取率和蛋白质质量分数两个指标，采用响应面分析法对罗望子多糖的提取工艺进行优化，以得到一种高效、经济的工艺，并获得符合国家标准的罗望子多糖，为工业生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗望子种仁由云南猫哆哩公司提供。

葡萄糖、半乳糖、木糖标准品购于Sigma 公司；无水乙醇、苯酚、硫酸、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸、硼酸购于源叶生物。

1.2 仪器与设备

ME2002E 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；FiveEasy pH 计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RCT 德国IKA 基本型加热磁力搅拌器（德国IKA 公司）；Avanti JXN-26 智能型高效离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SP-752 紫外可见分光光度计（上海光谱）；FOSS 全自动凯氏定氮仪Kjeltec 8400（瑞典FOSS 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 提取工艺

种仁去皮、粉碎、过筛后，按料液比1∶10 加入体积分数为80%的乙醇，室温搅拌6 h 后，离心（8 000×g，20 min）并除去上清液，将沉淀置于烘箱（40 ℃，12 h）烘干，获得除去小分子脂质、色素等杂质后的原料。

精确称取80 目原料5.0 g，按料液比1∶40 加入200 mL 去离子水，用1 mol/L 的柠檬酸溶液调节pH 至3.5，在磁力搅拌器上加热至80 ℃，待温度稳定后，恒温浸提20 min。将悬浊液静置冷却后离心（8 000×g，20 min），取上清液按体积比1∶1 倒入无水乙醇（一边快速搅拌，一边缓慢将乙醇倒入），使溶液的乙醇最终体积分数达到50%，4 ℃静置2 h 后过滤、取沉淀，真空干燥（40 ℃，8 h）后即可得到粗多糖。

1.3.2 单因素实验

原料目数：分别选择10，40，80，120，160 目原料，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定多糖提取率和蛋白质质量分数。

料液比：在获得上述最优条件的情况下，分别按料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60加入100，150，200，250，300 mL 去离子水，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定多糖提取率和蛋白质质量分数。

提取pH：在获得上述最优条件的情况下，分别调节溶液pH 至2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定多糖提取率和蛋白质质量分数。

提取温度：在获得上述最优条件的情况下，分别将溶液加热至60，70，80，90，100 ℃，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定多糖提取率和蛋白质质量分数。

提取时间：在获得上述最优条件的情况下，分别将溶液加热10，20，30，40，50 min，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定多糖提取率和蛋白质质量分数。

1.3.3 多糖提取率测定

采取苯酚硫酸法，测定粗多糖中的总糖含量。配制0.1 mg/mL 样品溶液，取1 mL 加入0.5 mL体积分数3%的苯酚溶液和5 mL 浓硫酸，振荡后静置20 min，在490 nm 处测定吸光度，通过标曲测定总糖含量，并计算得到多糖提取率。

式中：η 为多糖提取率；a 为总糖百分含量；m1为粗多糖质量，g；m0为原料质量，g。

1.3.4 蛋白质质量分数测定

采用凯式定氮法[14]测定多糖中蛋白质的质量分数pro，蛋白质换算系数为6.25。

1.3.5 响应面分析

以单因素实验的结果为基础，采用Design Expert 8.0.5 软件中的Box-Behnken[15]实验设计法对提取工艺进行优化，设计三因素三水平的响应面分析实验，分别用X1，X2，X3表示3 个关键因素，分别以-1，0，1 编码每一个自变量的低、中、高实验水平，以多糖提取率（Y1）和蛋白质质量分数（Y2）为响应值。根据软件给出的17 组不同提取条件提取多糖，并计算多糖提取率和蛋白质质量分数。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 原料目数对Y1，Y2 的影响

如图1（a）所示，多糖提取率和蛋白质质量分数都随着原料目数的变化而显著变化。其中多糖提取率随目数的升高，先上升后下降，在120 目时达到最高值。而蛋白质质量分数随着目数的升高，先下降后上升，并且在120 目达到最低值，因此选择120 目为最佳目数。

2.1.2 料液比对Y1，Y2 的影响

如图1（b）所示，多糖提取率随料液比的增加先略有上升后略有下降，但波动较小，多糖提取率在料液比1∶40 时达到最高值。料液比对蛋白质质量分数的影响并不显著，蛋白质质量分数在料液比1∶30 时达到最低值。因此，取1∶40 为最佳料液比，与王文光等[13]对最佳料液比的研究结果一致。

2.1.3 提取pH 对Y1，Y2 的影响

如图1（c）所示，pH 对多糖提取率的影响较小，在pH 2.5～4.5 提取率波动较小，在pH 升高至5.5 后提取率略有降低。而蛋白质质量分数随pH 的变化较大，随着pH 的降低，蛋白质质量分数先降低后升高，并在pH 3.5 达到最低值，因此，综合两项应变量，选择pH 3.5 为最佳pH。

2.1.4 提取温度对Y1，Y2 的影响

如图1（d）所示，多糖提取率随着提取温度的升高，先升高后降低，并在90 ℃达到最大值。而其中的蛋白质质量分数也是随着温度的升高，先升高后降低，但波动较小。90 ℃和100 ℃的多糖提取率和蛋白质质量分数都非常接近，而70 ℃的蛋白质质量分数是显著降低的，且从生产上来说，100 ℃的成本和能耗也更高。

2.1.5 提取时间对Y1，Y2 的影响

如图1（e）所示，多糖提取率和蛋白质质量分数随提取时间的延长并无显著变化。多糖提取率随时间的延长先略有上升，后在50 min 时下降；蛋白质质量分数随时间的延长稍有增加。因此，综合多糖提取率、蛋白质质量分数以及能耗情况来看，取20 min为最佳提取时间。

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面分析方案及结果

根据单因素实验结果可知，与原料目数、提取pH 和提取温度相比，料液比和提取时间对多糖提取率及蛋白质质量分数的影响都不显著，因此选择原料目数、提取pH 和提取温度为响应面的三因素进一步研究。采用Design Expert 8.0.5 软件中的Box-Behnken 实验设计法对罗望子多糖提取工艺进行分析，并处理实验数据。响应面的分析因素及水平见表1。

实验方案与结果见表2。对实验结果进行方差分析及方程拟合见表3、表4。

根据多元回归分析得到多糖提取率的回归方程[16]：

图1 不同因素对罗望子多糖提取率和蛋白质质量分数的影响Fig.1 Effect of different factors on the extraction yield and protein mass fraction of TSP

表1 响应面分析因素与水平Tab.1 Independent variables and levels for the response surface design

式中：A 表示原料目数；B 表示提取pH；C 表示提取温度。

如表3 所示，模型的P＜0.000 1，表明回归方程（2）极显著。模型校正决定系数Radj2=0.973 0，表明有97.30%可用该模型解释，而只有2.70%无法解释。模型确定系数R2=0.989 9，表明实际值和预测值的相关性良好[17]，此二次回归模型可用于分析罗望子多糖的提取率。由P 值可知，提取pH和提取温度对多糖提取率的影响极显著，原料目数对多糖提取率的影响显著。由F 值可知[18]，各因素对多糖提取率的影响贡献率为提取温度最高，其次为提取pH，最后为原料目数。交互项AB 和BC 影响显著，交互项AC 影响不显著，说明各影响因素对多糖提取率的影响不是简单的线性关系。

表2 罗望子多糖提取响应分析方案及结果Tab.2 Analysis scheme and results for the response surface design

根据多元回归分析得到优化提取工艺的回归方程：

如表4 所示，模型的P＜0.000 1，表明回归方程（3）极显著。模型校正决定系数Radj2=0.993 7，表明有99.37%可用该模型解释，而只有0.63%无法解释。模型确定系数R2=0.998 0，表明实际值和预测值的相关性良好[16]，此二次回归模型可用于分析罗望子多糖中蛋白质质量分数。由P 值可知，原料目数、提取pH 和提取温度对多糖提取率的影响均为显著。由F 值可知，各因素对蛋白质质量分数的影响贡献率为提取温度最高，其次为原料目数，最后为提取pH。交互项AB 影响显著，交互项AC 和BC 影响不显著，说明各影响因素对蛋白质质量分数的影响不是简单的线性关系。

表3 罗望子多糖提取率的回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis variance for the fitted regression model of TSP yield

表4 罗望子多糖中蛋白质质量分数的回归模型方差分析Tab.4 Variance analysis variance for the fitted regression model of protein mass fraction

2.2.2 交互作用分析

由图2（a）可知，提取温度不变时，固定原料目数，多糖提取率随提取pH 的降低呈升高的趋势；固定提取pH，多糖提取率随原料目数的提高先升高后降低（P＜0.05）。由图2（b）可知，提取pH 不变时，固定原料目数，多糖提取率随提取温度的升高呈升高的趋势；固定提取温度，多糖提取率随原料目数的提高先升高后降低。由图2（c）可知，原料目数不变时，固定提取温度，多糖提取率随提取pH 的降低呈升高的趋势；固定提取pH，多糖提取率随提取温度的升高呈升高的趋势（P＜0.05）。

图2 两因素的交互作用对罗望子多糖提取率和蛋白质质量分数的影响Fig.2 Influence of response surface plots of variable parameters on the TSP yield and protein mass fraction

由图2（d）可知，提取温度不变时，固定原料目数，蛋白质质量分数随提取pH 的降低先降低后升高；固定提取pH，蛋白质质量分数随原料目数的提高先升高后降低（P＜0.05）。由图2（e）可知，提取pH 不变时，固定原料目数，蛋白质质量分数随提取温度的升高先升高后降低；固定提取温度，蛋白质质量分数随原料目数的提高先降低后升高。由图2（f）可知，原料目数不变时，固定提取温度，蛋白质质量分数随提取pH 的降低先降低后升高；固定提取pH，蛋白质质量分数随提取温度的升高先升高后降低。

2.2.3 响应面分析最优罗望子多糖提取工艺条件

通过Design Expert 8.0.5 软件得出多糖提取率相对高且蛋白质质量分数相对低的工艺优化方案。

优化方案为：原料目数118 目，提取pH 3.06，提取温度90 ℃，罗望子多糖提取率的理论值为49.76%，蛋白质质量分数理论值为1.00%。以此条件进行验证实验，实际值为原料目数120 目，提取pH 3.1，提取温度90 ℃，罗望子多糖提取率的实际值为49.59%±0.36%，蛋白质质量分数实际值为1.02%±0.05%，表明实验实际值与模型预测值相符度高，该模型具有实际意义。与国内现有的研究[3,11-13]相比，该模型以多糖提取率代替多糖得率，更为准确地反映了产物中的多糖含量；且首次结合了多糖提取率和蛋白质质量分数两项指标，对提取工艺进行优化，使其操作简便、成本低廉，为罗望子胶的大规模生产提供一定的参考和理论依据。

3 结 论

本实验通过对罗望子多糖提取工艺的研究，初步确定了影响罗望子多糖提取率的主要因素，在单因素实验的基础上，本实验采用了响应面分析法，以高多糖提取率和低蛋白质质量分数为指标，对罗望子多糖的提取工艺进行了优化，从而得到的最佳工艺条件为：原料目数120 目，提取pH 3.1，提取温度90 ℃，罗望子多糖提取率为49.59%±0.36%，蛋白质质量分数为1.02%±0.05%，实验实际值与模型预测值相符度高，该模型具有实际意义。本实验所采用的提取工艺简单，成本低廉，为罗望子胶的大规模生产提供一定的理论依据。