小鼠Nud t9基因原核载体的构建及其生物信息学分析

林艳婷 庄育彬 张东东 胡丁旺 吴香新

（1.福建医科大学实验动物中心 福州 350122；2.福建医科大学医学技术与工程学院 福州 350004；3.福建医科大学基础医学院 福州 350122）

ADP核糖焦磷酸水解酶（Nudt）基因编码的蛋白质属于Nudix水解酶家族。Nudix盒存在于催化核苷二磷酸衍生物水解的多种酶家族中。这种酶是一种ADP核糖焦磷酸酶，催化ADP核糖水解为AMP和核糖-5-P。它需要二价金属离子和完整的Nudix基序来进行酶活化。当前人源NUDT9基因在国内外受到广泛关注，已有科学家发现了人源NUDT9基因编码不同亚型的剪接转录变体。NUDT9是一高特异性的ADP-核糖水解酶，在人体细胞内主要有两种转录形式：NUDT9α和NUDT9β，其中NUDT9α是一种对ADP-核糖和IDP-核糖高选择性的39kDa线粒体单体蛋白[1-3]，而在NUDT9β多肽上缺少线粒体信号肽，这一现象可能来自于NUDT9α的自剪切[3-4]。有研究表明NUDT9的N端结构域并非水解酶活性必须有的[4]，在NCBIGenBank中，大鼠Nudt9基因也存在两种变异体，似乎也存在人源NUDT9基因的这种现象。酵母双杂交实验显示其可与C17orf 215相作用，其复合物可阻止线粒体内的过度糖基化[3-5]。在已有的研究显示，阳离子通道TRPM2导致的钙离子途径细胞凋亡。而TRPM2细胞内C末端结构域与NUDT9极其相似，该通道的关闭被ADP-核糖的缓慢水解所控制[6-8]。原核表达作为结构生物学研究蛋白结构的重要基础，是结构生物学家们不可缺少的研究技术，同时原核表达也是抗体制备的抗原来源，帮助研究人员制备单克隆抗体和多克隆抗体，一直以来原核表达载体的构建在分子克隆实验中是不可或缺的实验技术。本文主要是通过PCR方法扩增小鼠Nudt9基因，将其克隆至原核表达载体，并进行PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定，进而对测序结果的基因进行生物信息学分析。蛋白质的各种结构及修饰对于蛋白的生物学功能研究具有重要意义，当前研究发现蛋白的信号肽、抗原肽、跨膜区域、结构域、磷酸化及糖基化等蛋白特性都是蛋白发挥生物学功能的重要基础，生物信息学分析有助于引导科研人员探索蛋白的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料 质粒pCMV-SPORT6-Nudt9（小鼠Nudt9基因，B086-C8）购自武汉淼灵生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Nudt9基因克隆至表达载体 在原引物对的5'端添加酶切位点及保护碱基，PCR扩增得到小鼠Nudt9基因条带，然后对条带进行回收纯化。纯化后的产物与pET-28a（+）载体同时进行双酶切，及纯化回收。酶切产物必须纯化回收后方可进行连接，使用T4 DNA Ligase置于4℃进行过夜连接。再进一步的转化及菌群扩增，提取质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定。将目的基因引物对与载体引物对进行组合PCR鉴定，分别为Nudt9 Forward与Nudt9 Reverse、T7 promoter与T7 terminator、Nudt9 Forward与T7 terminator、Nudt9 Reverse与T7 promoter。PCR鉴定后，在扩大菌群提取进行酶切鉴定，分别为重组质粒双酶切及重组质粒单酶切，完成后再送生物公司进行测序，并根据正确的测序序列绘制重组pET28a-Nudt9图谱。PCR引物序列见表1。

1.2.2 小鼠Nudt9基因的生物信息学分析 将小鼠Nudt9基因与NCBI基因库中的基因序列进行BLAST，确保获取正确的小鼠Nudt9基因，并选取不同的模式生物NUDT9基因运用DNATAR进行同源性分析，具体选取斑马鱼 （Zebrafish nudt9-NM_213352.2）、 牛 （Cattle NUDT9 -NM_001101096.2）、鸡 （Gallus XM_420546.6）、人（Human NUDT9-NM_024047.5）、大鼠（Norway rat Nudt9-NM_001006991.1）、 兔 （Rabbit NUDT9-XM_008267620.2）及 普 通 猕 猴 （Rhesus monkey NUDT9-NM_001261782.2）等7个物种的NUDT9基因。为对小鼠Nudt9蛋白的功能进行预测分析，分别运用Signal P 5.0 Server在线软件分析信号肽、TMHMM分析跨膜区域以及SMART在线软件分析结构域，再采用MANMEN分析蛋白多肽的抗原肽、NetNGlyc 1.0 Server在线软件分析N-糖基化位点以及NetPhos 3.1 Server软件预测磷酸化位点。

2 试验结果

2.1 重组质粒的鉴定结果 将目的基因引物对与载体引物对进行组合的PCR鉴定结果见图1，可见第1孔道有一条约为1 069 bp的条带，第2孔道有一条约为1 295 bp的条带，第3孔道有一条约为1 153 bp的条带，第4孔道有一条约为1 208 bp的条带，与预期结果相符合，说明目的基因插入载体的预期位置。

图1 重组质粒PCR鉴定结果

对重组质粒进行酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳后发现在第3泳道即双酶切的泳道中有一条约为1 055 bp的条带，其余泳道在5 000 bp以上出现质粒条带，见图2。

2.2 测序鉴定及基因序列的生物信息学分析 测序结果表明，小鼠Nudt9基因成功被克隆至表达载体pET-28a（+）上，重组pET28a-Nudt9图谱见图3。

2.2.1 小鼠Nudt9基因同源性分析 利用Snapgene软件，截取小鼠Nudt9基因序列，目的基因片段大小为1 053 bp，与NCBIGenBank在线比对分析。并运用DNAStar-MegAlign进行同源性分析，建立遗传进化树。由同源性分析表以及遗传进化树可以发现，重组至pET28a载体上的小鼠Nudt9基因与基因库中的同源性为100%。由图4可知，小鼠（5）与大鼠（6）的同源性最高，为92.9%；除斑马鱼（1）和鸡（3）外，同源性基本保持在82%以上，其中与人（4）的同源性为82.9%，这很有利于NUDT9基因开展实验动物研究，对实验人员来说具有重要意义，便于基因的各项人源化研究。

表1 PCR鉴定相关引物

图2 重组质粒酶切鉴定结果

2.2.2 小鼠Nudt9基因的生物学分析 运用DNAMAN软件将小鼠Nudt9基因转化为蛋白的氨基酸序列，该蛋白含有350个氨基酸，相对分子质量为38.6 kDa，p I为6.74；因载体上有His标签及肠激酶消化位点，故重组表达蛋白大小为40.8 kDa。

2.2.2.1 信号肽预测 由图5可知，该蛋白的信号肽约位于第1至第25个氨基酸，第26和第27个氨基酸可能就是信号肽剪切位点。

2.2.2.2 跨膜区域预测 由图6可知，该蛋白不存在跨膜区域，大部分蛋白的氨基酸位于生物膜外部。

2.2.2.3 结构域预测 由图7可知，通过SMART在线软件分析，发现该蛋白位于约192到331位置处存在140个氨基酸左右的核酸水解酶结构域。

2.2.2.4 抗原肽分析 利用DNAMAN软件将基因翻译成氨基酸序列，并分析小鼠Nudt9蛋白的抗原肽。由表2可知，该蛋白可能存在9条抗原肽，其中最长为29个氨基酸，最短为6个氨基酸。15个氨基酸以上的有5条，用于单克隆抗体制备已具备较多的选择性。

图3 原核表达质粒pET28a-Nudt9图谱

图4 小鼠Nudt9基因同源性分析

图5 小鼠Nudt9蛋白氨基酸序列信号肽位点分析

2.2.2.5 磷酸化位点预测 磷酸化是基因翻译后修饰的重要活化方式，对小鼠Nudt9蛋白进行磷酸化位点预测，见图8。在该蛋白上存在38个磷酸化位点，其中丝氨酸的磷酸化位点21个，苏氨酸的磷酸化位点11个，酪氨酸的磷酸化位点有6个。

2.2.2.6 N-糖基化位点预测 利用在线软件Net-NGlyc 1.0 Server对小鼠Nudt9蛋白的糖基化位点进行分析，有糖基化可能性的氨基酸约19个，达到阈值的糖基化位点有13个，见图9。

3 讨 论

1）经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定，本研究成功获得小鼠Nudt9基因的原核表达载体，该重组表达质粒pET28a-Nudt9将被用于小鼠Nudt9蛋白的大肠杆菌表达，继续开展结构生物学和各类抗体的制备实验。

图6 小鼠Nudt9蛋白跨膜区域预测

图7 小鼠Nudt9蛋白的结构域预测

表2 小鼠Nudt9蛋白抗原肽分析

2）已有研究人员发现了人源NUDT9基因编码不同亚型的剪接转录变体，在NCBI基因库中已有三种转录变异体。这一现象存在于多种模式生物中，在查找不同物种的NUDT9基因时，发现大鼠、鸡、拟南芥等模式生物存在不同的mRNA变异体，但较长的序列一般都包含了较短的序列，有研究预测该基因似乎在生物体中存在自剪切现象，但机制尚不清楚[9]；在NCBI基因库中存在第三种人源NUDT9（GenBank ID：NM_001248011.1），在该变异体上中间位置缺失96个核苷酸，是否存在类似于细胞内质网应激情况下IRE1对xbp-1的剪切现象[10]，尚待考查。在大鼠两个变异体中，其中一条变异体序列被包含在另一条变异体中。在NCBI库中查找鸡和兔Nudt9的CDS（Coding sequence，编码区）时，发现其mRNA有三种变异体，虽然有几个碱基存在差异，但是有一条较长序列，已经包含了其他两条较短序列，情况与人源NUDT9基因相似，因而也可能存在自剪切及其他修饰的可能性。

3）同源性分析表明，小鼠Nudt9与人源NUDT9基因具有较高同源性，有助于研究人员开展人源化相关实验，搜索人源化基因在实验动物上的研究。该蛋白的氨基酸序列含350个氨基酸，本研究预测结果发现，在该多肽上存在信号肽，但不含有跨膜区域，可能不会存在较多的主动跨膜行为；在其肽链上含有140个氨基酸左右的核酸水解酶结构域，位于肽链的末端。从其抗原肽上来看，长度适中，有两条抗原肽为26个和29个氨基酸，对于制备多克隆抗体，乃至单克隆抗体具有重要意义。

4）基因在经过一系列转录翻译后，为发挥其蛋白功能会发生一些磷酸化或者糖基化，其中蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它参与和调控生物体内的许多生命活动，通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程[11]。本研究磷酸化位点预测发现，小鼠Nudt9蛋白上存在38个磷酸化位点，可见其在细胞内扮演着重要作用，值得深入研究。蛋白质的糖基化是糖类在糖基转移酶（Glycosyhransferase，GTs）的催化下以共价键的形式与肽链连接的过程[12]，近年来晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products，AGEs）成为了全球医学界最为热门的领域之一，有众多的科研机构、大学、医院以及制药公司纷纷加入研究AGEs的行列，以期通过研究，缓解并治疗人体的衰老和很多慢性退化型疾病的发生。由此产生的糖基化终末产物受体（Advanced Glycosylation End Product Specific Receptor，AGER）也是科研人员研究的重点，在小鼠Nudt9蛋白上游13个超过阈值的糖基化位点以及6个可能存在的糖基化位点，如此之多的糖基化位点对于形成AGEs是一种较大的威胁，值得关注。且在其与人源NUDT9基因同源性达82.9%的情况下，通过对该基因的研究，进而拓展至人类疾病的研究具有重要意义。

图8 小鼠Nudt9蛋白磷酸化位点预测

图9 小鼠Nudt9蛋白糖基化位点预测