微波-亚硝基乙基脲诱变黑曲霉高产果胶酶的研究
2020-05-29杜国军张以超彭凯田英华刘祥王松
杜国军，张以超，彭凯，田英华，刘祥，王松
(1.齐齐哈尔大学，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省 普通高校重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
果胶酶是广泛存在于动植物及微生物中的能分解果胶质的一种复合酶[1]。它主要应用于环境保护、饲料与食品加工、植物抗病害、纺织行业、造纸洗涤等方面。来源于动植物的果胶酶提取难、产量低，而微生物则生长条件简单、成长快速、果胶酶产量大。因此，微生物是获取果胶酶的主要来源方式[2,3]。自然界中真菌、放线菌、细菌等都能够用来生产果胶酶。其中，黑曲霉是国际上公认的安全微生物菌株[4]。天然黑曲霉的果胶酶产量较低，通过简单有效的微生物诱变菌种，可以大幅提高黑曲霉的产酶能力[5]。微波作为物理诱变剂，具有易于操作、设备简单、高效安全等特点，化学诱变剂亚硝基乙基脲具有诱变用时短、剂量小、效果佳等优点，故本研究以微波及亚硝基乙基脲为诱变剂对黑曲霉进行复合诱变处理，采用透明圈法与固态发酵法选育出高产果胶酶性能稳定的黑曲霉突变菌株，以期为果胶酶的工业化生产奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
黑曲霉ZYC-06：齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室；果胶：生工生物工程(上海)股份有限公司；PB-10酸度计：赛多利斯科学仪器有限公司；微波炉：广东格兰仕集团有限公司；隔水培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.2 培养基
1.2.1 马铃薯培养基(PDA)
200 g去皮马铃薯，切块煮沸30 min，破碎，纱布过滤，加20 g琼脂及葡萄糖，补足蒸馏水至1000 mL，pH值自然。
1.2.2 果胶培养基
2.0 g琼脂，0.2 g果胶，0.1 g磷酸氢二钾，0.05 g硫酸镁，0.3 g硝酸钠，0.001 g硫酸铁，pH值5.5。
1.2.3 固体发酵培养基
0.25 g豆粕，10 g麸皮，0.1 g 硫酸铵，0.35 g硝酸钠，250 mL锥形瓶，按料液比1∶1.5加入pH调至5.5的蒸馏水。
1.3 实验方法
1.3.1 黑曲霉出发菌株初筛
取1支活化好的黑曲霉ZYC-06斜面菌株，用无菌生理盐水洗下孢子，无菌棉过滤后，置于装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡30 min分散孢子，制成浓度为106个/mL的均匀单孢子悬液。将单孢子悬液稀释103，104，105，106倍，用移液枪移取100 μL接种在无菌的PDA平皿上，均匀涂布，倒置，30 ℃条件下恒温培养5～7 d。用接菌环将单菌落接种于果胶培养基平皿，向平皿中加入5 mL卢戈氏碘液，静止2 min后，倒出碘液，加入5 mL生理盐水，10 min后倒出，观察是否有透明圈产生及透明圈的大小，选取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行复筛。
1.3.2 黑曲霉出发菌株复筛
将初筛得到的黑曲霉菌株接种于固体发酵培养基，进行固体发酵，30 ℃条件下恒温培养4～5 d，测其果胶酶活力，选取果胶酶活力较高的作为出发菌株。
1.3.3 果胶酶活力的测定
采用DNS比色法(3,5-二硝基水杨酸法)测定果胶酶活力[6]。具体方法：绘制D-半乳糖醛酸标准曲线，得标准曲线方程。取适当稀释的酶液0.5 mL于比色管中，加入2 mL pH 4.0的0.4%果胶溶液。45 ℃条件下恒温水浴30 min，加入DNS溶液混匀沸水浴5 min，流水冷却，蒸馏水定容至25 mL，520 nm测定吸光值，依据标准曲线方程计算半乳糖醛酸含量。酶活力定义为：在pH值3.0、温度50 ℃水浴条件下，每分钟分解果胶生成1 μmol半乳糖醛酸所需果胶酶的量为一个酶活力单位(U)。
1.3.4 黑曲霉的复合诱变处理
1.3.4.1 微波诱变处理
取1支出发菌种斜面，活化后，用无菌生理盐水洗下孢子，经过滤、振荡分散成单孢子悬液，加蒸馏水调整孢子浓度为106个/mL。用移液管吸取单孢子悬液，转入平皿中，每个平皿的单孢子悬液加入量为10 mL，将盛有单孢子悬液的平皿置于功率700 W、频率2450 Hz的微波炉中[7,8]，对单孢子悬液进行微波照射处理，时间为0，10，20，30，40，50，60，70，80 s。从平皿中吸取不同照射时间的单孢子悬液，适当稀释后，用移液枪吸取100 μL涂布于PDA平皿，每组实验做3个平行，30 ℃条件下恒温避光倒置培养5 d，统计菌落存活数量，确定最适微波诱变时间。然后按照微波最适诱变时间进行处理，选取高产果胶酶的黑曲霉突变菌株。
1.3.4.2 亚硝基乙基脲诱变处理
取经微波处理后透明圈直径与菌落直径比值较大的黑曲霉菌株，30 ℃条件恒温培养5 d，经过滤、振荡分散成单孢子悬液，加蒸馏水调整孢子浓度为106个/mL。用浓度0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的亚硝基乙基脲溶液分别对单孢子悬液进行诱变处理，10 min后加入2.0%的硫代硫酸钠溶液终止诱变。用移液枪吸取100 μL涂布于PDA平皿，每组实验做3个平行，30 ℃条件下恒温避光倒置培养5 d，统计菌落存活数量，确定最适亚硝基乙基脲诱变浓度。然后按照亚硝基乙基脲最适诱变条件进行处理，选取高产果胶酶的黑曲霉突变菌株。
1.3.4.3 绘制黑曲霉致死率曲线
按照公式致死率(%)=(未处理存活孢子数-处理存活孢子数)/未处理存活孢子数，计算出黑曲霉菌株的致死率，以诱变时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制出黑曲霉的致死率曲线。选择致死率在70%～80%范围内的处理条件作为微波及亚硝基乙基脲的最适诱变条件。
1.3.5 黑曲霉突变菌株初筛
方法同1.3.1。
1.3.6 黑曲霉突变菌株复筛
将初筛获得的黑曲霉突变菌株接种于固体发酵培养基，30 ℃条件下恒温培养4～5 d，每个培养基中加入25倍的蒸馏水，浸泡3 h，纱布过滤，得到黑曲霉发酵粗酶液。粗酶液加蒸馏水稀释1000倍，采用DNS法测定其果胶酶活力，选择果胶酶活力较高的突变株连续传5代，测其稳定性，最终获取正突变菌株中性能稳定且果胶酶活力高的黑曲霉突变菌株。
2 结果与讨论
2.1 微波诱变时间的确定
黑曲霉出发菌株ZYC-06经微波照射，得到不同照射时间的致死率，绘制出致死率曲线，结果见图1。
图1 黑曲霉出发菌株ZYC-06微波诱变致死率Fig.1 The lethallty rate of Aspergillus niger original strain ZYC-06 by microwave mutation
由图1可知，随着微波照射时间的延长，黑曲霉的致死率也明显增加。当照射时间为40 s时致死率为77%，80 s时黑曲霉菌株全部死亡，致死率达到100%。因此，黑曲霉ZYC-06的最适微波诱变时间确定为40 s。
2.2 微波诱变结果
将盛有黑曲霉ZYC-06单孢子悬液的平皿置于微波炉中诱变40 s后，果胶培养基涂布，30 ℃条件下培养5 d，采用透明圈法及固体发酵培养筛选出10株产果胶酶活力明显大于出发菌株的突变菌株，结果见表1。
表1 微波诱变结果Table 1 The results of microwave mutation
其中，黑曲霉ZYC-A05产果胶酶活力最高，达到了1469 U/g，透明圈图片见图2。
图2 黑曲霉突变株ZYC-A05Fig.2 Aspergillus niger original strain ZYC-A05
2.3 亚硝基乙基脲诱变浓度的确定
利用不同浓度的亚硝基乙基脲溶液对黑曲霉突变株ZYC-A05进行化学诱变处理，得到致死率曲线，结果见图3。
图3 黑曲霉突变株ZYC-A05亚硝基乙基脲致死率Fig.3 The lethallty rate of Aspergillus niger original strain ZYC-A05 by nitrosoethylurea
由图3可知，随着亚硝基乙基脲溶液浓度的增加，黑曲霉ZYC-A05的致死率也不断增加，在0.06 mg/mL时，致死率在70%～80%之间，故黑曲霉ZYC-A05的亚硝基乙基脲最适处理浓度为0.06 mg/mL。
2.4 亚硝基乙基脲诱变结果
使用浓度为0.06 mg/mL亚硝基乙基脲对黑曲霉ZYC-A05诱变处理10 min，终止后，涂布单孢子悬液于果胶培养基，30 ℃条件下恒温培养5 d，采用透明圈法及固体发酵培养筛选出6株产果胶酶活力明显大于出发菌株的突变菌株，结果见表2。
表2 亚硝基乙基脲诱变结果Table 2 The mutation results of nitrosoethylurea
其中，黑曲霉ZYC-B03产果胶酶活力最高，达到了2790 U/g，透明圈图片见图4。
图4 黑曲霉突变株ZYC-B03 Fig.4 Aspergillus niger mutant strain ZYC-B03
2.5 突变株产果胶酶稳定性
选取产果胶酶活力最大的黑曲酶突变株ZYC-B03进一步传代培养，连续传代5次，对其遗传稳定性进行检验，结果见表3。
表3 黑曲酶突变株ZYC-B03的传代培养情况Table 3 The passage culture situation of Aspergillus niger mutant strain ZYC-B03
由表3可知，突变株ZYC-B03在传代5次后，产果胶酶性能稳定且活力较高，平均产果胶酶活力2780 U/g。因此，黑曲霉ZYC-B03是一株可以用来研究果胶酶的优良实验菌种。
3 结论
本研究采用微波及亚硝基乙基脲为诱变剂，对黑曲霉ZYC-06进行诱变处理。结果表明：微波照射40 s，0.06 mg/mL亚硝基乙基脲处理10 min为最适诱变剂量，诱变后获得1株遗传性能稳定的黑曲霉突变株ZYC-B03，该突变株在30 ℃条件下恒温培养5d，产果胶酶活力达到了2790U/g，是出发菌株的2.88倍。
