响应面法优化芦笋多糖提取工艺及抗氧化性研究

李惠，熊忠飞，李喜宏

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457)

芦笋(AsparagusofficinalisL.)含有丰富的氨基酸、蛋白质和维生素等营养物质[1,2]，同时富含黄酮、多糖等生物活性物质[3,4]，故而，芦笋被冠以“蔬菜之王”的美誉。芦笋营养丰富，尤其芦笋多糖具有降血脂、抗肿瘤、提高免疫力等功效[5]。因此，芦笋多糖的提取研究日益受到广泛关注。

目前，国内外对多糖的提取主要有热水浸提法、超声波提取法、碱液提取法和乙醇提取法等[6,7]。传统热水浸提法存在得率低、周期长、能耗高等缺点。过酸或过碱提取环境易破坏多糖结构，导致生物活性降低。超声波在液体中通过高频振动产生空化效应，破坏细胞结构，利于多糖溶出和扩散。据报道，当超声波功率在300～500 W，多糖结构容易受到破坏，天然活性降低[8]。酶可有效使植物细胞壁和细胞膜分解[9]，提高多糖提取率。实验以芦笋老茎为原料提取多糖，通过低功率超声结合酶法技术，采用响应面实验优化工艺条件并测定抗氧化活性，旨在为芦笋多糖提取提供新的思路，为芦笋老茎资源的综合利用提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦笋：市售；果胶酶(1000 U/mg)、纤维素酶(50 U/mg)：上海源叶生物科技有限公司；石油醚、无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、硫酸亚铁、双氧水等：均为国产分析纯。

1.2 仪器

JJ-1000精密型电子天平 常熟双杰测试仪器厂；TU-1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Centrifuge 5804R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；PS-30AD数控超声波清洗器 深圳市洁康洗净电器有限公司。

1.3 实验处理

1.3.1 芦笋多糖提取工艺

芦笋老茎→清洗→切块→烘干→粉碎→筛分→称取→超声提取→酶提取→灭酶→抽滤→浓缩→醇沉→离心→芦笋粗多糖。

1.3.2 操作要点

将芦笋老茎清洗干净，去除泥沙，切块后置于60 ℃烘箱内烘干。将干芦笋用粉碎机粉碎后过60目筛，备用。精确称取芦笋粉1.000 g，按料液比加入蒸馏水进行超声提取。加入一定量的复合酶(纤维素酶∶果胶酶为1∶1)，水浴恒温提取1 h，90 ℃灭酶10 min，用真空抽滤机抽滤取滤液，用旋转蒸发器将滤液浓缩至30 mL。按照1∶3的比例向浓缩液中加入95%乙醇，4 ℃醇沉过夜，10000 r/min离心10 min后收集沉淀，沉淀即为芦笋粗多糖[10]。

1.3.3 多糖含量的测定

1.3.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确称量干燥至恒重的葡萄糖0.1000 g，用蒸馏水定容至1000 mL，制得浓度为100 μg/mL的葡萄糖溶液，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置于25 mL比色管中，用蒸馏水稀释至1 mL，分别加入1 mL 5%苯酚、5 mL浓硫酸，混匀后静置5 min，沸水浴20 min，迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白液，在波长490 nm处测吸光值[11]。

1.3.3.2 芦笋多糖得率的计算

芦笋粗多糖加水定容至100 mL，稀释100倍。取稀释液1 mL于25 mL比色管中，加入1 mL 5%苯酚溶液、5 mL浓硫酸，混匀后静置5 min，沸水浴20 min，迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白液，在波长490 nm处测吸光值。根据标准曲线方程计算多糖含量，多糖得率按照公式(1)计算：

(1)

式中：Y为多糖得率，%；M0为粗多糖质量，mg；M1为芦笋原料质量，mg。

1.3.4 单因素实验设计

准确称取1.000 g芦笋粉，在料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)，超声温度30，40，50，60，70 ℃，超声时间10，20，30，40，50 min，超声功率50，100，150，200，250 W，酶解时间20，30，40，50，60 min，加酶量1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，酶解温度30，40，50，60，70 ℃的条件下提取多糖，计算多糖得率，考察不同料液比、超声温度、超声时间、超声功率、酶解时间、加酶量及酶解温度对芦笋多糖得率的影响，每组测定3次。

1.3.5 响应面优化实验

在单因素基础上，选择加酶量(A)、超声时间(B)和料液比(C)3个因素，以多糖得率为考察指标，通过响应面实验优化超声酶法提取芦笋多糖工艺。响应面实验因素水平见表1。

表1 响应面实验的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.6 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny-1-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除能力的测定[12]

分别配制不同浓度的多糖溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于具塞试管中，混匀，室温避光反应30 min，于517 nm波长处测吸光度A0。以蒸馏水代替芦笋多糖溶液作为空白Ai，以无水乙醇代替DPPH溶液作为对照Aj。DPPH自由基清除率计算见公式(2)：

(2)

1.3.7 羟自由基(·OH)清除能力的测定[13]

根据Fenton反应原理，从不同浓度多糖溶液中准确量取1 mL，分别加入1 mL 2 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 2 mmol/L H2O2溶液，混匀后反应10 min，加入1 mL 2 mmol/L水杨酸溶液，混匀，37 ℃恒温反应30 min，于510 nm波长处测吸光值A0，用蒸馏水代替芦笋多糖作为空白Ai，用蒸馏水代替水杨酸溶液作为对照Aj。羟自由基清除率计算见公式(3)：

(3)

1.3.8 处理与分析方法

采用Origin 2017统计分析软件进行基础数据整理、分析与作图，利用SPSS 22.0统计软件进行方差分析，P<0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

以葡萄糖标准液浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，见图1。

图1 葡萄糖标准曲线 Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.1903x-0.1981，相关系数R2=0.9993。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对芦笋多糖得率的影响

图2 料液比对多糖得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

由图2可知，随着料液比增加，芦笋多糖得率先升高后趋于稳定，当料液比为1∶40时，芦笋得率最大，为4.12%，这可能是因为料液比较低时，溶液粘稠，细胞未完全空化，多糖提取不完全；料液比过高时，溶剂对超声波能量吸收也随之增大，导致芦笋粉吸收超声波能量减小[14]，细胞壁破碎不完全，多糖溶出效果下降。因此，选择最佳料液比为1∶40(g/mL)。

2.2.2 超声温度和超声时间对芦笋多糖得率的影响

图3 超声温度(A)和超声时间(B)对多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature (A) and ultrasonic time (B) on the extraction yield of polysaccharides

由图3中A可知，随着超声温度升高，多糖得率也随之增加，当超声温度达到50 ℃时，多糖得率最高。随着超声温度进一步升高，多糖得率开始降低。其原因可能是多糖溶解度随着超声温度的升高而增加，但是当超声温度超过阈值时，多糖中热敏性物质发生变性降解[15]，提取率会降低。因此，最佳超声温度为50 ℃。

由图3中B可知，多糖得率随着超声时间的延长先增大后减小。在超声时间30 min时最大，得率为3.67%。主要是因为超声波处理前期，细胞破碎程度大，细胞内的多糖溶出，多糖得率增大。但是超声波对多糖具有剪切作用[16]，处理时间太长会破坏多糖的结构，导致多糖得率下降。因此，选择超声波处理30 min效果最佳。

2.2.3 超声功率和酶解时间对芦笋多糖得率的影响

图4 超声功率(A)和酶解时间(B)对多糖得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power (A) and enzymolysis time (B) on the extraction yield of polysaccharides

由图4中A可知，当超声功率从50 W增加到150 W时，多糖得率增加，随后多糖得率呈下降趋势，其原因可能是随着超声功率的提高，超声的空化作用增强，破坏细胞壁，溶剂更易渗入细胞中，多糖提取率增加。继续增大超声功率，超声波的空化作用也会破坏多糖的结构，使得多糖提取率降低，因此选择150 W作为提取芦笋多糖的最佳超声功率。

由图4中B可知，随着酶解时间的延长，多糖得率随之增加。当酶解时间为50 min时，多糖得率最高，之后随着酶解时间进一步增加，多糖得率缓慢下降。主要是因为前期酶解时间短，酶解不充分，部分多糖未能充分溶出，酶解时间过长，已溶出的多糖发生水解。因此，最佳酶解时间为50 min。

2.2.4 加酶量和酶解温度对芦笋多糖得率的影响

图5 加酶量(A)和酶解温度(B)对多糖得率的影响Fig.5 Effect of enzyme additive amount (A) and enzymolysis temperature (B) on the extraction yield of polysaccharides

由图5中A可知，芦笋多糖得率随着加酶量的增加呈先上升后下降的趋势，当加酶量达到2.5%时，多糖得率最高，为4.11%。随着加酶量继续增加，多糖得率无显著性差异。其原因可能是：酶浓度增加，酶与底物接触的机会随之增加，水解的分子数目也不断增加，多糖溶出更多，由于加酶量达到一定程度后，溶液中的酶分子呈饱和状态[17]，过剩的酶无法与底物结合，多糖已基本溶出，多糖得率基本达到平衡，因而不再升高。因此，最佳加酶量为2.5%。

由图5中B可知，多糖得率随着酶解温度的升高而增加，当酶解温度为50 ℃时，多糖得率最高，为3.98%，然而酶解温度继续升高，多糖得率却下降。由于酶解温度升高，酶活加强，反应速度提高，但是酶解温度太高，部分酶变性失活[18]，多糖得率随之下降。因此，最佳酶解温度为50 ℃。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计和结果

在单因素实验结果的基础上，综合考虑各因素以及拐点波动大小等对多糖得率的影响，选择加酶量、超声时间和料液比3个因素为自变量，以芦笋多糖得率为响应值，设计三因素三水平实验，共包括17组实验方案，结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果 Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 响应面分析

利用Design-Expert软件对表2中的数据进行拟合，得到芦笋多糖提取率的回归方程：Y=4.084+0.084A-0.034B+0.17C+0.013AC-0.092BC-0.094A2-0.41B2-0.24C2。

对回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归方程各项的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注：“*”表示差异显著(P<0.05)；“**”表示差异极显著(P<0.01)。

回归模型的P值<0.0001，差异极显著，失拟项P值为0.5570，差异不显著，说明回归模型具有良好的拟合度，可以用来分析和预测芦笋多糖的最佳提取工艺。模型相关系数R2为0.9882>0.80，说明98.82%以上的数据都可以通过该数学模型来解释。证明回归方程具有较高的可信度。在3个因素中，对芦笋多糖提取率影响大小依次为料液比>加酶量>超声时间。一次项A，C、交互项BC和二次项A2、B2、C2对实验结果影响极显著(P<0.01)，一次项B、交互项AB、AC对实验结果影响不显著(P>0.05)，这说明各因素之间与多糖提取率是非线性关系。

响应值芦笋多糖得率受各因素A、B、C相互作用影响变化构成三维空间曲面图，从响应面图和等高线图上可直观反映出单个因素及两个因素之间的相互作用。不同影响因子间的响应面及等高线图见图6。曲线越陡峭，说明该条件改变对响应值影响越大；曲线越平缓，说明因子对响应值的影响越小。

图6 各因素交互作用对多糖含量影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface diagrams and contour diagrams of the interactive effects of various factors on the yield of polysaccharides

由图6可知，图6B中曲面图坡度大于图6A、图6C中，图6A、图6C中等高线图几乎为圆形，所以超声时间和料液比对芦笋多糖得率影响极显著[19]，超声时间和加酶量、加酶量和料液比的相互作用不明显，这一结论与表3的分析结果相吻合。通过对响应面回归方程进行分析，确定最佳提取工艺条件为：料液比1∶43.8，加酶量2.734%，超声时间29.159 min。在最佳提取条件下，芦笋多糖提取率为4.137%。实际操作中，料液比为1∶44，加酶量为2.7%，超声时间为29 min，在最佳提取条件下进行3次验证实验，最终芦笋多糖平均提取率为4.12%，与理论预测值相比，相对误差为0.41%，实验重现性较好，结果稳定，具有有效性。

2.4 抗氧化能力结果分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力

图7 芦笋多糖对DPPH自由基清除能力 Fig.7 Scavenging ability of asparagus polysaccharides to DPPH free radical

由图7可知，芦笋多糖对DPPH自由基的清除能力较强。在质量浓度20～100 μg/mL范围内，芦笋多糖对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加先增加后趋于稳定，清除能力低于相同浓度的Vc对DPPH自由基的清除能力。当浓度为60 μg/mL时，芦笋多糖对DPPH自由基的清除能力趋于稳定，基本保持在74%左右，其对DPPH自由基的清除能力可达到Vc对DPPH自由基清除能力的2/3以上，表明芦笋多糖具有良好的清除DPPH自由基的能力。

2.4.2 羟自由基清除能力

图8 芦笋多糖对羟自由基清除能力 Fig.8 Scavenging ability of asparagus polysaccharides to hydroxy free radical

由图8可知，在质量浓度为0.2～0.6 mg/mL范围内，随着质量浓度的增加，芦笋多糖对·OH的清除能力逐渐增强，质量浓度从0.2 mg/mL增加到0.6 mg/mL，对·OH的清除率从41.02%增加到68.73%，而Vc对·OH的清除率一直维持在极高水平。在质量浓度为0.6 mg/mL时，芦笋多糖对·OH的清除率达到Vc对·OH清除率的50%以上，说明芦笋多糖具有较好的清除·OH能力。

3 结论

本研究优化了超声波辅助酶法提取芦笋多糖的提取工艺参数。芦笋多糖提取率的影响顺序为料液比>加酶量>超声时间，最佳工艺参数为料液比1∶44 (g/mL)、超声时间29 min、加酶量2.7%。在此最佳条件下芦笋多糖得率可达4.12%，且具有较好的抗氧化能力。研究证明，超声波辅助酶法提取工艺具有提取温度低、超声处理时间短、酶解效率高等优点，高效可靠，实用价值高。