基于网络药理学的金水六君煎治疗慢性阻塞性肺疾病作用机制研究

岳勤霏，陈叶青，范欣生

(南京中医药大学中医学院·中西医结合学院，江苏 南京 210023)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以呼吸系统症状和气流受限为特征的临床常见疾病，通常由香烟烟雾等有害颗粒和气体暴露引起的气道和(或)肺泡异常导致[1]，其机制主要与气道和肺慢性炎症、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及细胞凋亡等有关[2]。由于患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题。在我国，COPD是严重危害人民身体健康的重要慢性呼吸系统疾病[1]。

金水六君煎出自《景岳全书》，滋阴而不留邪，化痰而不伤阴，是养阴化痰的代表方剂。现代研究表明，金水六君煎能有效缓解COPD患者的临床症状，改善肺功能，提高患者运动耐力及生活质量[3]，也可减轻COPD患者咳嗽严重程度、频率、咯痰量，改善喘息症状[4]，是中医治疗COPD的有效方剂，其作用机制有待进一步探究。

本研究运用网络药理的技术和方法，构建金水六君煎治疗COPD的成分-靶点网络，分析该方多成分-多靶点间复杂网状关系，预测其防治COPD的潜在靶标和作用机制，为临床研究和实验研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 金水六君煎方源

金水六君煎出自《景岳全书·新方八阵》：“治肺肾虚寒，水泛为痰，或年迈阴虚，血气不足，外受风寒，咳嗽呕恶，多痰喘急等证”[5]，由熟地、当归、陈皮、半夏、茯苓、炙甘草、生姜组成。

1.2 金水六君煎的化学成分及其对应靶点挖掘

采用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology)获取金水六君煎中各个中药的化学成分以及其对应靶点。

1.3 COPD相关靶点挖掘

以“Chronic obstructive pulmonary disease”为关键词在TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中搜索获得COPD相关靶点。以“Chronic obstructive pulmonary disease”为关键词在CTD数据库(http://ctdbase.org/)中搜索，选取Inference Score排序前200个基因收入COPD相关靶点中。

1.4 金水六君煎与COPD交集靶点及功效成分筛选

将在TCMSP数据库中获得的药物成分靶点与在TTD、DisGeNET、GeneCards数据库以及CTD数据库中获得的COPD相关靶点进行对应，获得金水六君煎与COPD交集靶点。将交集靶点通过UniProt数据库，规范为人源(Homo sapiens)的标准基因，作为靶点标准化名称。

根据交集靶点结果，筛选交集靶点与药物成分中对应的功效成分。

1.5 成分-靶点网络构建及分析

根据上述金水六君煎与COPD交集靶点、功效成分筛选结果，在Excel表格中建立彼此对应关系，然后导入到Cytoscape 3.7.2软件，构建成分-靶点网络。利用STRING数据库和Cytoscape 3.7.2自带工具cytoHubba插件对靶点蛋白相互作用网络进行基本网络拓扑结构分析，选取自由度(Degree)，介数(Betweenness)和中心性(Closeness)都大于平均值的靶点为关键靶点。

1.6 GO富集分析和KEGG富集分析

将交集靶点导入OmicShare开放平台(http://omicsmart.com/)，进行GO富集分析以及KEGG富集分析。

2 结果

2.1 金水六君煎的化学成分及其对应靶点挖掘

通过TCMSP数据库获得地黄成分76个，靶点153个；当归成分125个，靶点191个；陈皮成分63个，靶点150个；半夏成分116个，靶点396个；茯苓成分34个，靶点60个；甘草成分280个，靶点305个；生姜成分265个，靶点683个。去重以后共获得金水六君煎药物成分870个，靶点982个。

2.2 COPD相关靶点挖掘

通过TTD数据库获得COPD相关靶点65个；通过DisGeNET数据库获得COPD相关靶点13个；通过GeneCards获得COPD相关靶点6 060个；通过CTD数据库获得COPD相关靶点200个。去重以后共获得COPD相关靶点6 141个。

2.3 金水六君煎与COPD交集靶点及功效成分筛选

将药物成分靶点与COPD相关靶点进行对应，获得96个交集靶点，其中单味药特有靶点有47个，2味药共有靶点有14个，3味药共有靶点有13个，4味药共有靶点6个，5味药共有靶点有5个，6味药共有靶点有6个，7味药共有靶点有5个，如表1所示。对得到的96个交集靶点进一步分析发现其主要可分为以下7类：①与炎症相关靶点；②与气道重塑相关靶点；③与氧化应激相关靶点；④与蛋白酶/抗蛋白酶失衡相关靶点；⑤与气道平滑肌收缩与气道黏液高分泌相关靶点；⑥与激素调节相关靶点；⑦与代谢相关靶点。

根据金水六君煎与COPD交集靶点筛选结果，从获得的药物成分中筛选金水六君煎的功效成分共435个，列出其中涉及靶点数量频次排列前20的成分如表2所示。

表1 金水六君煎与COPD交集靶点

表2 金水六君煎治疗COPD部分功效成分

2.4 成分-靶点网络构建及分析

利用Cytoscape 3.7.2软件将筛选出来的435个功效成分与96个交集靶点构建成分-靶点可视化网络，网络中2 230条边，直观地呈现了435个化合物、96个靶点间的相互作用，如图1所示。通过STRING数据库和网络拓扑分析，筛选自由度、介数、中心度数均超过平均值的靶点有20个，见表3。对这20个关键靶点进一步分析发现：①与炎症相关靶点有TNF、NR3C1、STAT3、CRP、AHR；②与氧化应激相关靶点有：HMOX1、MPO、CAT、SIRT1；③与蛋白酶/抗蛋白酶失衡相关靶点为α1-AT；④与气道重塑和气道黏液高分泌相关靶点有：MAPK3、MAPK8、EGFR、MAPK1、VEGFA、PPAR-γ；⑤与激素调节和代谢相关靶点有：LPL、GCG、INS。推测这些靶点可能是金水六君煎治疗COPD的关键靶点。

表3 金水六君煎中自由度、介数、中心度数均超过平均值的靶点信息

2.5 GO富集分析

利用OmicShare开放平台对金水六君煎与COPD的96个交集靶点进行GO富集分析，确定了1 409个GO条目(P<0.01,FDR<0.01)。其中生物过程相关条目1 246个，富集最显著的为对生物和化学刺激的反应、多种细胞生物过程、细胞增殖、免疫、代谢、运动、行为、排毒、生物调节等。分子功能相关条目97个，富集最显著的为催化活性、抗氧化活性、分子换能器活性、分子功能调节剂、转录调节活性等。细胞组成相关条目66个，富集最显著的为细胞外区域部分、膜封闭腔、细胞器部分、细胞连接、突触等，如图2所示。

2.6 KEGG富集分析

利用OmicShare开放平台对金水六君煎与COPD的96个交集靶点进行KEGG富集分析得到62条结果(P<0.01，FDR<0.01)，其中有17条通路在COPD治疗中发挥重要作用：①与炎症与免疫相关通路有10条，包括白细胞介素17(IL-17)信号通路、IgE高亲和力受体(FcεRI)信号通路、C型凝集素受体信号通路、Th17细胞分化、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化、TNF信号通路和cAMP信号通路；②与氧化应激与炎症相关通路有3条，包括缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、叉头转录因子O(FoxO)信号通路和TNF信号通路；③与蛋白酶/抗蛋白酶失衡相关的通路有1条，为转化生长因子β(TGF-β)信号通路；④与气道重塑与气道黏液高分泌相关的通路有4条，包括MAPK信号通路、表皮生长因子受体(ErbB)信号通路、TGF-β信号通路、VEGF信号通路；⑤与细胞生长与死亡相关的通路有1条，为细胞凋亡。根据P值列出17条富集通路，如图3所示。

3 讨论

金水六君煎治疗COPD成分-靶点网络分析发现，方中药物含有大量成分，且成分可作用于多个靶点，或多个成分作用于同一个靶点，体现出中药复方多成分、多靶点协同作用的特点。同时，靶点可能来自于单味中药，也可能来自于多味中药，体现了中药复方既有单味药的独有贡献，也有多味药协同作用的特点。

金水六君煎作用于96个与抗炎、抗氧化、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、气道重塑、气道平滑肌收缩与气道黏液高分泌、激素调节以及代谢相关的靶点，推测MAPK3、TNF、PPAR-γ、LPL、HMOX1、MAPK8、NR3C1、MPO、CAT、SIRT1、MAPK1、STAT3、GAPDH、GCG、CRP、AHR、α1-AT、INS、VEGFA、EGFR为治疗COPD的关键靶点，与抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡、改善气道重塑与气道黏液高分泌以及激素调节与代谢相关。GO富集分析显示，金水六君煎能介导对生物和化学刺激的反应、免疫系统过程，具有转录调节活性和抗氧化活性等。KEGG富集分析发现，金水六君煎通过与抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡、细胞凋亡以及改善气道重塑与气道黏液高分泌相关通路治疗COPD。

金水六君煎化学成分如异鼠李素(Isorhamnetin)、异甘草素(Isoliquiritigenin)、异甘草黄酮醇(Isolicoflavonol)、胀果香豆素甲(Inflacoumarin A)等，作用于TNF、NR3C1、STAT3、CRP、AHR等靶点，通过IL-17信号通路、TNF信号通路等多条通路发挥抗炎作用。山奈酚(Kaempferol)、甘草酸(Glycyrrhizin)、刺芒柄花素(Formononetin)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(Methylbutenol)等成分作用于HMOX1、MPO、CAT、SIRT1等靶点，通过HIF-1信号通路、FoxO信号通路等多条通路发挥抗氧化损伤作用；柚皮苷(Naringenin)、川陈皮素(Nobiletin)、槲皮素(Quercetin)、熊果酸(Ursolic acid)等成分作用于α1-AT、MAPK3、MAPK8、EGFR、MAPK1、VEGFA、PPAR-γ等靶点，通过MAPK信号通路、EGFR信号通路、TGF-β信号通路等多条通路，抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡，改善COPD气道重塑与气道黏液高分泌。

气道和肺部炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化和抗氧化失衡是COPD的主要发病机制[2]。研究表明，COPD患者肺组织和外周血中Th17细胞比例和IL-17A表达显著升高[6]，血液和气道中炎症细胞因子TNF-α水平升高[7-8]，血清中性粒细胞弹性蛋白酶水平升高，α1-AT水平降低，蛋白酶/抗蛋白酶失衡[9]。香烟烟雾刺激诱导的COPD模型小鼠，机体产生氧化应激反应，从而激活核因子E-2-相关因子(Nrf2)核转录，抑制其靶基因HMOX1表达[10]。调节SIRT1/FOXO3a通路，抑制HIF-1α的表达与释放，可改善COPD炎症及氧化应激状态[11-12]。异鼠李素可以抑制TNF-α诱导的炎症反应[13]。异甘草素可通过减轻炎症和氧化应激，抑制香烟诱导的COPD[14]。山奈酚是黄酮类化合物，具有抗氧化和抗炎活性，对COPD有治疗作用[15-16]。

气道重塑与气道黏液高分泌是COPD的主要病理特征[17]，以气道壁组织结构改变、管腔狭窄、气流受限等为主要表现[18]。研究表明，MAPK活化与COPD气道重塑相关[19]。降低COPD大鼠VEGFA表达水平，可抑制气道重塑从而改善COPD[18]。PPAR-γ的激活可抑制炎症及氧化应激反应，参与COPD患者黏液高分泌调控[20-21]。柚皮苷可通过改善肺功能，减少炎细胞，降低白细胞介素-8(IL-8)，TNF-α水平来治疗COPD[22]，对气道重塑有保护作用[23]。槲皮素可降低肺泡灌洗液和肺组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α在内的炎性细胞因子水平，抑制香烟烟雾引起的气道重塑[24]。

综上所述，部分印证了本研究的网络预测结果，据此推测，金水六君煎治疗COPD的作用机制主要与抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及改善气道重塑和气道黏液高分泌相关。

4 结论

金水六君煎通过435个功效成分作用于96个靶点，17条信号通路，主要通过抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡、改善气道重塑和气道黏液高分泌，多成分、多靶点、多通路协同作用来治疗COPD，为深入探讨金水六君煎治疗COPD的效应机制提供了基础资料。