肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定

宋新华，陈旭娇，邓冯沂，高守红，彭 辉 （.宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 6000；.浙江大学第二附属医院肾内科，浙江 杭州 000；.海军军医大学附属长征医院药学部，上海 0000；.宜春市人民医院，江西 宜春6000）

肾衰宁颗粒由太子参、黄连、制半夏、陈皮、茯苓、大黄、丹参、牛膝、红花、甘草等十味中药制成；具有补气健脾，活血化痰，祛浊的功效[1]。有文献表明，肾衰宁在治疗慢性肾脏疾病中疗效较为显著[2]；在尿毒症腹膜透析患者的治疗过程中能够降低血清硫酸吲哚酯浓度[3]；对于慢性肾脏病的Ⅳ期患者，在西医基础治疗的同时服用肾衰宁颗粒，可以明显改善肾功能，同时提升患者的治愈率，具有较高的临床使用价值[4]。由于中药成分复杂[5]，使得如何控制中药的质量成为十分重要的问题。指纹图谱是在了解中药物质整体作用的基础上，通过光谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，以鉴别中药的真伪，评价质量的一致性和产品的稳定性，其具有信息量大、特征性强、完整性和模糊性等特点[6]。指纹图谱中的质量控制技术既能保证中药的功效，又在实现中药现代化过程中起关键性作用[7]。因此，本实验以10个批次的肾衰宁颗粒为研究对象，拟建立肾衰宁颗粒的指纹图谱，对肾衰宁颗粒进行质量评价。

肾衰宁颗粒是由十味中药组成的复方制剂，其化学成分十分复杂，且许多复方治疗疾病的药物基础并不明显，因此检测成分必须是发挥药效的有效成分[8]，本实验针对大黄中的大黄酚（chrysophanol）[9-10]、丹参中的丹酚酸 B（salvianolic acid B）[11]、陈皮中的橙皮苷（hesperidin）[9,12]3 种指标性成分，进行HPLC法含量测定。在多成分的质量控制检测成本高而对照品紧缺的情况下，能较大程度地节约检验成本，又可较全面地控制该制剂的质量，保证临床用药的有效性和安全性，同时为肾衰宁颗粒的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国 Agilent公司），包含G1311C四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B-DAD二极管阵列检测器，Chemstation色谱工作站；光电分析天平（德国Sartorius公司，CPA 225D 型），最大载荷 220 g，分度值0.01 mg；冷冻真空浓缩仪（丹麦Labogene公司，ScanVac ScanSpeed 40 型）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，SK7200H型）；涡旋混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，Vortex QL-901型）。

1.2 试剂

肾衰宁颗粒（德元堂制药集团，批号：51103111、51103009 346、51103010 471、51103011 593、 51103105、 51103018 486、 41103033 563、51103110、 61103102、 61103101）。蜕皮激素（ecdysterone，批号：P11N6F5706）、甘草苷（liquiritin，批号：2O1027BA14）、甘草酸（glycyrrhizic acid，批号：230A6B1）、大黄酚（chrysophanol，批号：T31O6F5345）、丹酚酸B（salvianolic acid B，批号：Y14M7H14804）、橙皮苷（hesperidin，批号：K02M3C1）对照品，均由上海源叶有限公司提供。大黄素（modin，批号：110756-200110）、盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，批号：09030522）对照品，由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈、甲酸，均为德国Merck公司生产，色谱纯。二氯甲烷，色谱纯。水为纯净水，娃哈哈公司生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters SunFire™ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相 A：乙腈；流动相 B：0.1% 甲酸溶液，梯度洗脱。流速：1 ml/min。柱温：25 ℃。进样量：10 μl。检测波长：254 nm。梯度洗脱条件见表 1。

表 1 梯度洗脱条件

2.2 对照品溶液的制备

精密依次称取丹酚酸B、橙皮苷、大黄素标准品 10.25、10.35、10.05 mg，分别置于 10 ml容量瓶中，以纯甲醇定容至刻度，摇匀，得储备液并将其分装后储存于-20 ℃的冰箱中。精密称取10.10 mg大黄酚，置于10 ml容量瓶中，加入少量二氯甲烷溶解，超声处理3 min，然后用纯甲醇稀释至刻度，摇匀，得到对照品的储备液，置于-20 ℃冰箱保存。

2.3 供试品溶液的制备

取肾衰宁颗粒适量，研磨成细粉，混合均匀，精密称取0.10 g，加适量70%甲醇溶液使其溶解，超声 45 min，再用 70% 甲醇溶液定容至 2 ml，冷却，过0.45 μm微孔滤膜后，取续滤液进样分析。

2.4 肾衰宁颗粒 HPLC 指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验

取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），按照“2.3”项制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样5次，通过大黄素（7号色谱峰）作为参照峰，确定相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间的RSD在1.0%以内，相对峰面积的RSD在2.0%以内，表明进样仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），按照“2.3”项平行制备5份供试品溶液，测定在“2.1”项色谱条件下的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内，相对保留面积RSD在2.0%以内。表明该实验方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），并根据“2.3”项下平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别记录 0、4、8、24、36 h的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内，相对保留面积RSD在2.0%以内。表明供试样品溶液在36 h内稳定性好。

2.5 指纹图谱结果与分析

分别称取10个批次的肾衰宁粉末，按照“2.3”项制备供试品溶液，每个批次平行制备3份供试品溶液，记录图谱，见图1。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008A版”的软件，将10批次肾衰宁颗粒的图谱导入，将批号为61103102的样品溶液用作针对相似性计算校正的参考图。结果显示，1～9批制剂间指纹图谱与对照图谱之间相似度均不小于0.90，见表2，表明相似度良好。对保留时间0～60 min内的色谱峰进行分析，均有22个稳定的特征峰，确定其为肾衰宁的共有指纹峰，经过标准品比对，其中，6号峰为橙皮苷，14号峰为丹酚酸B，21号峰为大黄酚。

图 1 10 批肾衰宁颗粒的色谱图

表 2 10 批肾衰宁颗粒 HPLC 指纹图谱相似度

2.6 肾衰宁颗粒中 3种有效成分的含量测定

2.6.1 线性结果考察

按照“2.2”项下制备标准品溶液，得到混合对照品色谱图见图2。将标准品储备液用纯甲醇稀释，丹酚酸 B浓度梯度为：10、20、40、80和 100 μg/ml；橙皮苷浓度梯度为：40、80、160、320 和 400 μg/ml；大黄酚浓度梯度为：8、16、40、100和 350 μg/ml。在“2.1”项色谱条件下，分别记录3种成分的峰面积，以峰面积（Y）对浓度（Χ）进行线性回归，结果见表3。

2.6.2 精密度试验

取同一对照品溶液，根据“2.1”项下色谱条件进行测定，重复进样5次，并记录峰面积。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚峰面积的RSD分别为0.17%、0.20%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 检测限和定量限

精密吸取橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚对照品溶液适量，使用甲醇逐步稀释，至色谱图中上述3种成分的峰高分别为噪音的3倍和10倍，测得橙皮苷的检测限和定量限分别为0.18和1 μg/ml；丹酚酸B的检测限和定量限分别为0.3和1.2 μg/ml；大黄酚的检测限和定量限分别为1和5 μg/ml。

图 2 混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）色谱图

表 3 各成分线性关系

2.6.4 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：41103033 563），并根据“2.1”项色谱条件在 0、2、4、8、24、36 h测定。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为2.01%、2.22%、2.05%，结果表明：供试品在36 h内稳定。

2.6.5 重复性试验

取同一供试品溶液（批号：41103033 563），平行制备6份，并根据“2.1”项色谱条件进行测定，橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为0.67%、2.00%、2.02%，表明系统重复性良好。

2.6.6 加样回收率试验

精密量取肾衰宁溶液1 ml，分别加入100%含量橙皮苷对照品（理论值为 192.02 μg），100% 含量丹酚酸 B对照品（理论值为 62.66 μg），100%含量大黄酚对照品（理论值 35.22 μg），按照“2.2”项平行制备6份，并根据“2.1”的色谱条件进行测量，按照下述公式计算加样回收率，平均加样回收分别为119.20%、84.69%、84.58%。结果见表4。

回收率=（实测量-样品含量）/加入量×100%。

2.6.7 样品含量测定

取10批肾衰宁颗粒，按“2.2”项制备试液，按“2.1”项色谱条件测定，结果见表5。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

在190～400 nm处全波长扫描，盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚、丹酚酸B、蜕皮激素、甘草酸、甘草苷、橙皮苷分别在 345、254、254、286、250、237、237、283 nm 处有最大吸收，通过对比分析，在波长254 nm处，上述8种成分具有良好的响应，样品中相邻色谱峰的基线分离可以满足含量检测的要求。因此，选择波长254 nm作为检测波长。

3.2 样品前处理的方法优化

将肾衰宁粉末直接用水溶解后进样，发现样品出峰很少，所测成分在色谱条件下没有吸收。后用 50%、70%、80%的甲醇溶解样品，发现用70%甲醇溶解出峰数最多，且所测成分在此条件下均有吸收，故选择70%甲醇进行样品的前处理。

3.3 流动相的选择

有文献报道，肾衰宁含量测定使用甲醇-0.1%磷酸[13]、乙腈-水-1%甲酸[14]、乙腈-05%磷酸[15]进行90 min的大梯度洗脱，发现色谱峰分不开，且特征峰较少。经过反复实验，确定乙腈-0.1%甲酸水溶液用作梯度洗脱的流动相，分离出样品中测得的特征峰，特征峰很多，峰形良好。

表 4 加样回收率试验结果

表 5 10 批肾衰宁样品中 3 种成分的测定结果