正五聚蛋白3和肝素结合蛋白在肺结核诊断中的价值

邢志伟 高艳军 张聪瑶 朱梅玲 张建武

结核病是最常见并可致命的一种传染病，尽管目前全球在医疗技术方面取得了新进展，但结核病仍然是公共卫生方面的一项重要挑战[1]。世界卫生组织报告2016年新增结核病1 100万例，死亡140万例[2]。由于结核病诊断方法的局限性，所以缺乏最佳诊断方法，临床医生仍然面临着早期诊断的困惑[3]。结核病的早期检测在控制疾病和防止感染蔓延方面具有重要作用。正五聚蛋白(pentraxin，PTX)3属于机体免疫系统保守的多聚体蛋白超家族，它的成员包括短五聚体蛋白和长五聚体蛋白。所有这些蛋白质在先天免疫中起着关键作用，通常被认为是急性期免疫蛋白，它们对机体的调节作用有多种，如炎症、血管生成、肿瘤生成、细胞粘附等[4]。相关文献表明，PTX3在先天性病原体抵抗和炎症调节中发挥了重要作用[5]， PTX3也是一种重要的血清学标志物，包括心血管疾病、败血症和癌症在内的多种临床炎症和感染条件下，能迅速反映局部组织的炎症和损伤[6]。肝素结合蛋白(heparin binding protein，HBP)储存在中性粒细胞的分泌颗粒和嗜苯胺蓝颗粒中，在细胞激活时释放。HBP是一种多功能促炎介质，例如激活免疫细胞，具有广泛的抗菌活性，并诱导血管渗漏。血浆HBP被认为是一种评价严重脓毒症和脓毒性休克进展的预测因子[7]。细菌性脑膜炎[8]时脑脊液和尿路感染[9]时尿液中的HBP水平也升高，这表明HBP可作为指示细菌感染的生物标记物。最近，HBP被认为是支气管肺泡灌洗液中检测肺移植受者肺部感染的重要生物标记物[10]。本研究测定活动性肺结核患者，潜伏性结核感染者以及健康对照者外周血中PTX3和HBP的表达水平，探讨它们对肺结核诊断的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 (1)肺结核组：收集2017年3～12月在我院结核科住院的初治肺结核患者125例，其中男77例，女48例；年龄21～63岁，平均年龄(40.2±11.7)岁。肺结核诊断参照中华人民共和国卫生行业标准(WS288-2017)，以病原学实验室检查为主，结合胸部影像学、流行病学和临床表现，以及其他相关辅助检查和鉴别诊断进行综合分析作出的诊断。肺结核患者根据影像学诊断，分为肺部有空洞组31例，无空洞组94例；肺结核患者给予标准化治疗2HRZE/4HR抗结核方案治疗6个月。(2)潜伏感染组：收集同期潜伏性结核感染109例，其中男51例，女58例；年龄22～65岁，平均年龄(41.3±13.6)岁。细菌学检测即痰涂片及培养确定阴性，而PPD试验阳性，有结核病接触史，结合临床症状及影像学表现无肺结核特征。(3)对照组：来自同期进行体检的健康者112例，其中男65例，女47例；年龄26～60岁，平均年龄(38.9±10.5)岁。3组间年龄和性别比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象排除糖尿病、高血压、自身免疫性疾病等，且均无合并其他传染性疾病如病毒性肝炎、HIV等感染，均为汉族。本研究经医院伦理委员会批准，收集标本已和所有患者及志愿者签署书面知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 (1)总RNA提取试剂Trizol LS购自Invitrogen公司。(2)聚合酶链(PCR)反应体系购自宝生物工程(大连)有限公司。(3)PCR上下游引物购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。(4)PCR扩增仪(LightCycler 480Ⅱ，Roche公司)；人HBP的ELISA试剂盒(杭州中翰盛泰生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本收集：研究对象空腹采集静脉血，收集在EDTA抗凝管， 3 000 r/min离心10 min，分离的血浆可置于-80℃保存。肺结核组标本收集在抗结核治疗前、抗结核治疗3个月及6个月后采血。

1.3.2 总RNA提取：向分离所得的部分血浆中加入Trizol LS试剂，体积比为1∶3，操作步骤按说明书进行提取总RNA，最后室温干燥RNA沉淀，加入无RNase的水溶解RNA，放-80℃保存备用。

1.3.3 RT-PCR实验检测PTX3的mRNA水平：RNA提取后首先反转录合成cDNA，严格按试剂盒说明书提供的步骤进行操作。以反应产物cDNA为模板进行PCR扩增，体系包括1 μl cDNA模板，2 μl的10倍PCR缓冲液(含Mg2+)，0.3 μl的TaqDNA聚合酶(5 U/μl)，0.5 μl dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物各0.5 μl(10 mmol/L)。PTX3的上游引物是 5’-CGTTT

GCGGTTAGGAGTATTC-3’ 和下游引物5’- CAAAACG

TCGTCCGTAACTTA -3’,扩增片段长度为103 bp， GAPDH上游引物5’- GACCACTTTGTCAAGCTCATTT

CC-3’，下游引物5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCC- TCTTGT- 3’,扩增片段长度为323 bp。PCR扩增条件包括95℃预变性10 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环后72℃延伸10 min。取扩增产物，直接加样于1.2%琼脂糖凝胶加样孔中，80V电压，电泳30 min，用凝胶成像系统拍摄分析各电泳条带，mRNA表达相对值等于目的片段光密度值/GAPDH光密度值。

1.3.4 ELISA实验检测HBP的表达：操作按试剂盒说明书进行，根据酶标仪的吸光度换算HBP的含量。

2 结果

2.1 3组PTX3和HBP的表达 采用RT-PCR检测3组PTX3的mRNA表达，潜伏感染组的表达较对照组差异无统计学意义(P>0.05)，肺结核组PTX3的表达较潜伏感染组和对照组表达均明显升高(P<0.01)；采用ELISA检测3组HBP，显示肺结核组较潜伏感染组和对照组表达均有显著升高(P<0.01)。见表1。

组别PTX3 (mRNA)HBP(ng/ml) 对照组(n=112) 0.83±0.31∗15.06±2.94∗潜伏感染组(n=109)0.93±0.33∗16.28±4.49∗肺结核组(n=125) 2.18±0.9924.90±6.02F值142.15155.66P值0.0000.000

注：与肺结核组比较，*P<0.05

2.2 PTX3和HBP的表达与肺结核患者肺部空洞的关系 肺结核患者中有空洞组中PTX3和HBP的表达均显著高于无空洞组，差异有统计学意义 (P<0.01)。见表2。

组别PTX3(mRNA)HBP(ng/ml)有空洞组(n=31)3.27±0.7631.65±3.77无空洞组(n=94)1.82±0.7822.70±4.84t值9.069.41P值0.0000.000

2.3 肺结核患者治疗前后PTX3和HBP表达比较 所有初治肺结核患者均接受规范化抗结核治疗3个月及6个月，与治疗前相比，治疗 3 个月和6 个月PTX3和HBP表达水平均显著下降，所有患者抗结核治疗效果良好；且接受治疗6个月组与接受治疗3个月组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

时间PTX3(mRNA)HBP (ng/ml)治疗前 2.18±0.9924.90±6.02治疗3个月1.29±0.45∗18.93±4.91∗治疗6个月0.98±0.25∗#16.95±4.38∗#F值 115.9680.71P值0.0000.000

注：与治疗前比较，*P<0.05；与治疗3个月比较，#P<0.05

2.4 受试者工作曲线(ROC)评估PTX3和HBP的诊断效能 绘制肺结核组的ROC曲线，PTX3和HBP有较好的诊断价值：AUC 显示为0.855和0.849，以1.47为临界值，PTX3鉴别肺结核患者的敏感度和特异度分别为 72.8%和87.9%；以 18.68 ng/ml为临界值，HBP鉴别肺结核患者的敏感度和特异度分别为82.4%和71.9%。见图1。

3 讨论

五聚体蛋白是一个发育保守的多聚体蛋白超家族，其特征是在其羧基末端存在一个保守的8个氨基酸长序列。根据其N端氨基酸的长度主要分为短五肽和长五肽，短五肽和长五肽具有不同的蛋白质大小，在不同的基因启动子的影响下由不同的基因合成。PTX3是一种多功能蛋白，具有多聚体结构和保守域，与其他长五聚蛋白一样，PTX3蛋白包含一个独特的N末端区域和一个与短戊聚糖同源的C末端区域，可由多种炎症相关刺激诱导。PTX3是一种急性期反应物，对原发性促炎信号和微生物识别反应迅速产生，PTX3作为一种可溶性模式识别受体，可与多种病原体/损伤相关分子模式结合，在先天免疫系统中起着重要作用，可作为一种激活经典补体途径的调理素[11,12]。

图1 PTX3和HBP诊断肺结核的ROC曲线

它的多重作用可以被认为是位点特异性的，因为它的产生发生在多种细胞类型中，包括内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肝细胞和单核细胞等。PTX3与多种免疫相关性疾病有密切关系，发挥多种生物学反应，参与机体的免疫防御、炎性反应、血管重塑等。有实验表明急慢性炎症疾病中外周血 PTX3 水平迅速增加，且存在时间持久[13]。PTX3对病原体的识别等方面有重要的调节作用，是宿主防御某些感染的关键成分，在脓毒症患者血清中，PTX3浓度明显高于对照组，PTX3水平与脓毒症严重程度相关，可以有助于脓毒症病情预测以及脓毒症和脓毒性休克的鉴别诊断[14]。Azzurri等[15]探讨了PTX3在感染疾病中作为生物标记物的作用，新诊断的结核病患者中PTX3水平高于健康家庭对照和社区对照，在治疗方案结束时，受试者对治疗反应显著降低了PTX3水平，而治疗失败的患者，PTX3水平进一步升高，表明该蛋白的检测可能有助于监测疾病活动和治疗效果。

HBP是新近被发现的炎症标志物之一，HBP一旦释放，表现出强烈的促炎活性。在感染部位，HBP的化学作用是吸引和激活更多的中性粒细胞，也包括T淋巴细胞和单核细胞。HBP与单核细胞β2整合素结合，启动细胞内信号传导过程，引起趋化因子和促炎介质的释放。HBP通过促进巨噬细胞对病原体的识别和吸收，有助于抗菌药物的清除。此外，HBP通过与管腔细胞表面糖胺聚糖相互作用以及激活蛋白激酶C和Rho激酶途径，激活内皮细胞并增加内皮通透性。HBP已被证明是疑似败血症的一个有价值的诊断标志物[16]，在严重的败血症患者中显示出良好的预后和鉴别特性[17]。实验和临床证据支持该蛋白在脓毒症引起的器官功能障碍的病理生理学中发挥重要作用[18]。最近研究也表明HBP水平的升高与危重患者的循环衰竭、肾衰竭和死亡率有关[19]。有文献显示胸腔积液HBP水平诊断效能高，能较好区分胸腔积液患者的肺炎旁胸腔积液，可能是肺炎旁胸腔积液鉴别诊断的生物标志物[20]。

PTX3和HBP带来的多重影响现在越来越受到关注。研究结果显示肺结核组外周血PTX3和HBP水平显著高于潜伏感染组和对照组(P<0.05)，提示在活动性肺结核患者中PTX3和HBP表达升高，但潜伏感染组和对照组PTX3和HBP的结果无统计学差异。根据不同临床表型进行分组分析，结果提示肺部有空洞结核患者 PTX3和HBP水平高于无空洞患者， PTX3和HBP的水平与临床表现的严重程度显著相关。PTX3和HBP在肺结核发病中发挥重要作用，我们发现它们的表达变化与疾病的进展有关，可能影响宿主对于结核分枝杆菌的免疫应答。活动性肺结核患者接受标准抗结核治疗，且患者抗结核治疗效果良好。本研究对患者随访6个月，发现与治疗前相比，在抗结核治疗3个月后PTX3和HBP水平明显下降，且随着治疗时间延长，PTX3和HBP表达量逐渐降低。当接受6个月抗结核治疗后， 随访患者的PTX3和HBP已下降至正常水平，与对照组比较无统计学差异。

本研究应用ROC曲线分析PTX3和HBP的诊断效能以及鉴别肺结核患者的敏感度和特异度。ROC曲线是以1-特异度为横坐标，灵敏度为纵坐标，并可用曲线下面积反映实验诊断的价值大小。对肺结核组绘制ROC曲线，结果显示PTX3和HBP具有较高的敏感度和特异度。提示PTX3和HBP对活动性肺结核诊断有一定的优势，对病情的评估有指导作用，可能是区别活动性和潜伏性结核感染的较敏感指标。

综上所述，本实验研究PTX3和HBP的表达变化，可作为辅助诊断肺结核病的主要依据之一，有望成为MTB感染期间炎症和疾病活动的重要生物标志物，使我们更加深入地了解结核分枝杆菌的发病机制，为今后结核病的早期治疗及改善结核病的结局，发挥重要的临床应用价值。因为PTX3和HBP水平可能受到复杂的过程和途径中多种因素影响，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和特定的启动子基因[21]，所以根据具体情况，制定适合各种疾病的血浆PTX3和HBP检测目标，更好的解释疾病的发病机制、诊断或预后。