UPLC-MS/MS法测定人血浆中卡马西平浓度

张 静，袁宇琳，熊 雯（成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610000）

卡马西平（carbamazepine，CBZ）为三环类抗癫痫药物，是治疗癫痫单纯及复杂部分性发作的首选药之一，在临床上被广泛应用。由于卡马西平治疗窗窄，个体差异大，在临床上常需要进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）以保证药物治疗的安全性和有效性[1]。为提高药代动力学生物样品检测质量，卫生部临床检验中心（以下简称临检中心）自2014年起，在全国范围内开展药代动力学检验室间质量评价活动（以下简称室间质评），评价项目为人血浆中CBZ的浓度测定[2]。本研究建立并验证了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定人血浆中CBZ浓度方法，本方法特异性好，精密度高，准确度好，使用该方法测定的室间质评样品结果顺利通过了考核，可供参与此项室间质评的相关实验室参考。

1 资料与方法

1.1 试药试剂

卡马西平对照品（EDQM，批号：006539，含量：99.9%），卡马西平-d8（carbamazepine-d8, CBZ-d8）对照品（加拿大TRC公司，批号：18-MVI-22-3，含量：96%），乙腈、甲酸为色谱纯级，水为超纯水，空白人血浆购自Bioreclamation IVT公司（抗凝剂为K2EDTA）。

1.2 仪器

LC-30A型超高效液相色谱仪（日本岛津公司），Triple Quad 5500质谱仪（美国Applied Biosystems公司），XPE105型电子分析天平（法国METTLER TOLEDO公司），5810R型超速离心机（德国Eppendorf公司），VORTEX-T GENIE 2型旋涡混合器（美国SCIENTIFIC INDUSTRIES公司）。

1.3 色谱与质谱条件

色谱柱为Waters Xselsect®CSHTMC18柱（75 mm×2.1 mm，2.5 μm），流动相A为含0.05%甲酸的水溶液，流动相B为含0.05%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱（0→0.8 min，A：95%→2%；0.8→2.0 min，A：2%；2.0→2.2 min，A：2%→95 %；2.2→3.1 min，A：95%），流速0.3 mL·min-1，柱温40 ℃。

采用电喷雾离子源（ESI），多反应监测（MRM）正离子模式。离子源温度500 ℃，离子喷雾电压5500 V，辅助加热气压力50 psi，雾化气压力50 psi，气帘气压力35 psi，碰撞气9 psi，去簇电压10 V，碰撞电压28 V。用于定量分析的离子对分别为：m/z237.1→194.1（CBZ），m/z245.0→202.1（CBZ-d8）。

1.4 标准品溶液和内标溶液的配制

精密称取CBZ对照品10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，得浓度为100 μg·mL-1的CBZ储备液；取CBZ储备液加水进行稀释，配得所需浓度的系列CBZ标准工作液。

取CBZ-d8对照品1 mg（一个包装），用乙腈溶解并定容至100 mL，得浓度为10 μg·mL-1的CBZ-d8储备液；取CBZ-d8储备液加水进行稀释，配得CBZ-d8浓度为500 ng·mL-1的内标工作液。

1.5 血浆样品的处理方法

取血浆样品50 μL，加入10 μL内标工作液，旋涡混合15 s后，再加入340 μL乙腈，旋涡混合30 s后，于12 000 g、4 ℃离心10 min，吸取上清液20 μL，再加入0.05%甲酸水溶液380 μL稀释，旋涡混合15 s，取100 μL至进样瓶中，进样2 μL。

2 结果

2.1 方法的选择性

在本实验条件下，考察了6个来源的血浆，结果显示6个来源的血浆在CBZ和内标出峰处均无内源性物质干扰，CBZ及内标峰形良好，保留时间均为1.70 min。表明该方法选择性良好，内源性物质不干扰测定。

2.2 标准曲线及定量下限

用空白血浆加CBZ标准工作液，分别配制得到浓度为5、10、20、50、100、300、800、1000 ng·mL-1的血浆标准曲线样品，按“1.5”项下进行处理，进样分析。以CBZ浓度为横坐标（x），CBZ与内标峰面积的比值为纵坐标（y），采用加权（1/x2）最小二乘法进行线性回归，CBZ连续3天的标准曲线回归方程见表1。结果表明，CBZ在5～1000 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，线性相关系数（r）范围为0.999 3～0.999 9。

配制定量下限浓度的血浆样品6份，按“1.5”项下进行处理，进样分析，连续测定3 d。批内精密度为2.66%～4.10%，批内准确度为101.05%～106.33%，批间精密度为3.71%，批间准确度为103.38%。

表1 线性回归方程Tab 1 Linear regression equation

2.3 残留

在标准曲线最高浓度（1000 ng·mL-1）血浆样品进样后，再进样空白样品以评价残留效应。测定结果为卡马西平的峰面积低于定量下限的20%，内标峰面积低于样品的5%，表明该方法残留效应小，残留对分析无影响。

2.4 准确度和精密度

配制4个浓度（15、50、500、750 ng·mL-1）的质控血浆样品各6份，按“1.5”项下进行处理，进样分析，连续测定3 d，计算批内、批间准确度和精密度见表2。结果表明，该方法批内和批间准确度和精密度良好。

表2 批内、批间精密度和准确度.n=6Tab 2 Intra-day and inter-day precisions and accuracies.n=6

2.5 基质效应

取6个不同来源的血浆，按“1.5”项下进行处理获得空白上清液，分别加入标准品溶液配制4个浓度（15、50、500、750 ng·mL-1）的血浆样品各3份，进样分析，记录峰面积为AM。用水代替血浆加入标准品溶液配得相应的溶液样品，进样分析，记录峰面积为AW。基质效应=AM/AW×100 %，内标归一化基质效应=CBZ基质效应/内标基质效应×100%。结果见表3，6种不同来源的血浆CBZ和内标基质效应均较小，表明该方法基质效应小，血浆基质不干扰测定。

2.6 回收率

配制4个浓度（15、50、500、750 ng·mL-1）的质控血浆样品各6份，按“1.5”项下进行处理，进样分析，记录峰面积为AE。取空白血浆按“1.5”项下处理获得空白上清液，分别加入标准品溶液配制相应浓度的的血浆样品各6份，进样分析，记录峰面积为AS。回收率=AE/AS×100%。结果显示，CBZ浓度为15、50、500、750 ng·mL-1时，回收率依次为97.77%、102.02%、98.74%、100.89%，内标（500 ng·mL-1）回收率为99.13%，表明该方法回收率良好。

2.7 稀释验证

配制浓度为1500 ng·mL-1的血浆样品各6份，用空白血浆稀释2倍得到浓度为750 ng·mL-1的质控血浆样品，按“1.5”项下进行处理，进样分析。稀释2倍的血浆样品与理论值的准确度偏差为–1.33%，RSD为2.22%，表明样品稀释2倍测定不影响该方法的精密度与准确度。

2.8 稳定性和进样重复性实验

配制浓度为15、750 ng·mL-1的质控血浆样品各6份，分别考察血浆样品2次冻融（–80 ℃冷冻，取出后室温解冻，重复2次）、室温放置（日光，6 h）、进样室放置（10 ℃，11 h）稳定性和自动进样器进样3次重复性。将处理后样品的测定结果与理论浓度进行比较，结果见表4。结果表明，血浆样品反复冻融2次、室温放置6 h和进样室放置11 h均稳定，自动进样器进样重复性良好。

表3 CBZ和内标的基质效应.±s，n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s，n=3

表3 CBZ和内标的基质效应.±s，n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s，n=3

基质编号内标基质效应/%01 104.47±1.62 101.19±1.68 102.45±1.31 101.76±0.73 103.22±0.13 099.87±0.25 107.12±2.10 106.42±1.01 103.23±0.53 02 103.66±0.68 100.37±0.59 102.74±0.22 102.80±1.32 104.93±0.93 100.67±0.20 109.18±1.98 107.43±3.16 103.26±0.67 03 103.01±1.46 100.62±0.68 102.29±0.46 102.81±0.74 103.07±0.70 101.08±0.20 107.32±2.45 106.59±2.55 102.37±1.55 04 100.96±1.45 100.07±1.40 100.36±0.70 101.65±0.68 102.95±0.41 101.47±0.58 106.46±1.94 107.60±1.28 100.88±0.06 05 100.93±0.90 099.83±0.78 099.08±0.78 101.77±0.69 101.10±1.70 100.80±0.73 102.09±2.83 104.05±1.17 101.10±0.75 06 100.69±0.98 100.76±0.28 099.43±0.56 102.61±0.49 100.09±0.41 100.26±0.25 103.88±1.52 106.76±1.63 099.93±1.03 750 ng·mL-1 500 ng·mL-1 75 ng·mL-1 15 ng·mL-1 500 ng·mL-1 CBZ基质效应/%CBZ内标归一化基质效应因子/%CBZ基质效应/%CBZ内标归一化基质效应因子/%CBZ基质效应/%CBZ内标归一化基质效应因子/%CBZ基质效应/%CBZ内标归一化基质效应因子/%

表4 样品稳定性和进样重复性结果.±s，n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s，n=6

表4 样品稳定性和进样重复性结果.±s，n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s，n=6

理论浓度/ng·mL-1冻融2次 室温放置6 h 进样室放置11 h 重复进样3次准确度/% CV/% 准确度/% CV/% 准确度/% CV/% 准确度/% CV/%15 096.4±2.21 2.30 097.49±1.30 1.33 96.06±3.17 3.30 94.45±3.42 3.62 750 102.49±0.59 0.58 101.28±1.82 1.80 99.99±1.12 1.12 99.99±0.64 0.64

2.9 质控样品测定

按“1.5”项下处理临检中心送检的5个未知浓度CBZ血浆样品，进样分析，具体结果见表5。质评结果表明，所有质评样品测定结果均在允许范围内。

表5 室间质评中5个样品的测定结果Tab 5 Results of 5 samples in external quality assessment

3 讨论

3.1 现状

目前，文献报道的卡马西平血药浓度测定方法主要有免疫分析法[3]、高效液相色谱-紫外（HPLC-UV）法[4-5]、高效液相色谱-二极管阵列（HPLC-DAD）法[6]和液质联用法[7]。

其中，免疫分析法操作简便快速、自动化程度高，适用于临床急症的快速分析；但选择性不佳，代谢物易干扰药物浓度的测定，且依赖于进口试剂盒，分析成本较高。HPLC-UV法和HPLC-DAD法选择性强、灵敏度高，但分析物和干扰物质必须达到色谱分离才能准确定量，方法开发时对预处理和色谱条件要求较高，且灵敏度低于液质联用法；谢燕如等[8]报道的反相高效液相色谱法测定人血浆中卡马西平浓度，其定量下限为1000 ng·mL-1，单个样品分析时间为7 min。液质联用法较HPLC法分析时间更短，选择性更好，灵敏度更高，孙晓清等[9]报道的UPLC-MS/MS法同时检测人血浆中卡马西平和苯巴比妥浓度，卡马西平定量下限可达10 ng·mL-1，单个样品分析时间为3 min。本研究确定的液-质联用法定量下限为5 ng·mL-1，单个样品分析时间为3.1 min，操作简便快速、专属性好、灵敏度高，适用于低浓度样品的快速测定。

3.2 条件优化

本研究在选择流动相时，考察了不同水相：0%、0.05%、0.10%、0.20%浓度的甲酸水溶液，不同有机相：甲醇、乙腈以及含不同浓度甲酸的甲醇、乙腈溶液，最终确定水相为含0.05%甲酸的水溶液，有机相为含0.05%甲酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，分析时间为3.1 min，色谱峰形良好，无内源性物质干扰，分析时间短。在开发样品预处理方法时，考察了不同沉淀剂及体积，显示乙腈沉淀效果优于甲醇，优化得到的乙腈加入体积既保证沉淀效果也保证待测物响应。沉淀后上清液中加入0.05%甲酸水溶液作为稀释液，可以降低生物基质对质谱检测器的干扰，同时水相的加入大大改善了色谱峰形。本研究采用CBZ-d8为内标，内标与待测物结构及理化性质相似，在处理过程中提取率一致、质谱响应相似，使得该方法重现性良好，批内和批间精密度和准确度良好，回收率高，基质效应低。

3.3 室间质评结果分析

通过建立的方法测定5个质评样品全部通过，且与靶值偏差小于4.5%，表明该方法结果准确可靠。分析质评结果可知，实测值较理论值存在正偏差，提示该方法可能存在一定的系统误差，也可能为质评样品在运输和存放过程水分减少样品浓缩导致。同时，质评结果还显示高浓度样品的偏差较低浓度更大，可能是由于线性拟合时采用加权（1/x2）最小二乘法，使得拟合方程时更偏重于低浓度导致。

综上，本研究建立并验证了UPLC-MS/MS法测定人血浆中CBZ浓度，该方法简单快速、灵敏度高、特异性好、重现性好，符合临检中心关于药代动力学实验室生物样品检测的要求，尤其适用于低浓度血浆样品的快速分析，可应用于室间质评、TDM及人体生物药代动力学样品测定。