慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清IFN-γ基因多态性分析*

高朋彬，赵晓彦，王德华，秦 浩，孟明辉，张建集，闫双缓，郑欢伟

慢加急性肝衰竭((acute on chronic liver failure，ACLF)是指在慢性肝病基础上出现急性肝损伤和肝功能失代偿而导致的肝功能衰竭[1]。ACLF具有发病急、病情发展速度快，病情严重、治疗困难且效果差、短期病死率高等特点，在临床上受到广泛的关注[2,3]。ACLF患者病死率高达50%～90%[4]。ACLF的病因较为复杂，在我国，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是导致ACLF的最主要的病因[5]。近年来，慢加急性乙型肝炎肝衰竭(HBV-ACLF)发病率逐年升高，部分地区HBV-ACLF在肝衰竭患者中占比已高达80%[6]。早期发现并采取积极的内科治疗可使患者病情得到显著的缓解[7,8]。HBV-ACLF的发病机制尚不完全明确，但多数学者认为机体免疫反应异常起到了重要的作用[9]。γ-干扰素(IFN-γ)是人体发生炎症反应时重要的血清细胞因子，具有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等特征，在人体免疫防御过程中发挥重要的作用[10,11]IFN-γ还参与诱导干细胞凋亡等[12]。有研究证明，IFN-γ基因与免疫应答机制关系密切[13]。IFN-γ基因的单核苷酸多态性(SNP)可对细胞因子的转录、翻译和表达过程造成影响，进而导致细胞因子含量及免疫功能的差异。因此，我们猜测IFN-γ可能与HBV-ACLF发生存在一定的病理生理学关联。本研究检测了HBV-ACLF患者外周血IFN-γ基因SNP位点+874T/A和+2109A/G基因型和等位基因分布特征，以期为及时准确地预测患者预后提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2017年5月～2019年9月我院诊治的HBV-ACLF患者60例，男性38例，女性22例；年龄为24～76岁，平均年龄为(47.45±6.24)岁。诊断符合中华医学会发布的《肝衰竭诊治指南》的标准[14]。排除标准：(1)伴有严重的心、脑功能障碍；(2)伴有恶性肿瘤或严重的全身性疾病；(3)经影像学检查发现存在肝硬化；(4)近期使用过免疫调节剂治疗。另选择我院同期健康体检人群60例为对照组，男性39，女性21例；年龄为23～74岁，平均年龄为(46.78±6.35)岁。全部研究对象或家属签署知情同意书，本研究经过我院医学伦理委员会审查。

1.2 基因提取和SNP位点基因分型检测 空腹采集静脉血5 mL，EDTA-K2或肝素抗凝，置于离心管中，加入TE 800μL混匀，在室温下以12 000 r/m离心1 min，重复5～6次，直至完全溶解。再加入TE 400μL，10%SDS 25μL，20 mg/ml PK 5μL，37℃消化过夜。吸上层清液，加入等体积的酚，摇荡15 min，以12000 r/min离心10 min，再次吸上层清液；加入等体积的酚：氯仿(1:1)，摇荡15 min，以12000 r/min离心10 min，吸上清液；再加入等体积的氯仿，振荡15 min，以12000 r/min离心10 min，吸上清液；加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 M乙酸钠，于-20℃下沉淀1 h，以12000 r/min离心10 min，弃上清液，向沉淀中加入75%乙醇，以12000 r/min离心5 min，弃上清液，干燥后用TE 100μL溶解，置于-20℃冷藏备用。使用罗氏LightCy-cler480实时荧光定量PCR仪，采用TaqMan探针荧光定量PCR法行IFN-γ SNP位点-159C/T基因分型(Taq-Man Genotyping Master Mix、TaqMan探针以及引物均购自美国ABI公司。PCR反应体积为10μL(引物见表1)，反应条件为95℃预变性10 min，92℃变性15 s、60℃退火1 min，共40个循环，40℃延伸5 min。应用罗氏LightCycler480荧光定量分析软件LCS480 1.5.1.62对实验数据进行基因分型。随机对SNPs位点的不同基因型样本进行测序，以验证Taqman基因分型的结果。

表1 IFN-γ基因引物序列

1.3 肝肾功能指标检测 使用Stago-Evolution血凝仪(法国Stago公司)及其配套试剂检测凝血酶原时间(prothrombin time)，计算凝血酶原活动度(PTA)；使用日立7600全自动生化分析仪及其配套试剂检测肝肾功能指标。

1.4 统计学方法 应用SPSS 21.0软件处理数据，采用x2检验和Hardy-Weinberg平衡检验IFN-γ基因SNP位点+874T/A和+2109A/G基因型和等位基因频率分布差异，采用Logistic回归模型计算基因型和基因组模型OR值及其95%置信区间(CI)，以P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 两组人群基本特征 见表2。

2.2 两组IFN-γ基因+874T/A多态性位点基因型和等位基因频率分布比较 IFN-γ基因+874T/A位点存在TT、TA和AA三种基因型。ACLF患者与健康人基因型分布频率存在显著性差异(P<0.05)；在等位基因频率分布结果中，ACLF患者T等位基因频率显著低于对照组，而A等位基因频率显著高于对照组，差异具有统计学意义(P均<0.05，表3)，提示T等位基因是患者发生HBV-ACLF的保护性基因，而A等位基因可能是患者发生HBV-ACLF的风险基因。

表2 两组人群基本特征

表3 两组IFN-γ+874T/A位点基因型和等位基因频率分布(%)比较

SNPACLF(N=60)对照组(N=60)x2OR(95%CI)P+874T/A基因型TT29(48.3)34(56.7)TA12(20.0)18(30.0)6.0780.82(0.51～1.43)0.048AA19(31.7)8(13.3)等位基因T70(58.3)86(71.7)4.6890.61(0.42～1.15)0.030A50(41.7)34(28.3)

2.3 两组IFN-γ基因+2109A/G多态性位点基因型和等位基因频率分布比较 IFN-γ基因+2109A/G位点存在AA、AG和GG三种基因型。ACLF患者与健康人基因型分布频率存在显著性差异(P<0.05)；在基因型频率分布结果中，ACLF患者显性等位基因纯合子AA基因型频率显著低于对照组，隐性等位基因纯合子GG基因型频率显著高于对照组(P<0.05)；在等位基因频率分布结果中，ACLF患者A等位基因频率显著低于对照组，G等位基因频率显著高于对照组，差异具有统计学意义(P均<0.05，表4)，提示A等位基因是患者发生HBV-ACLF的保护性等位基因，而G等位基因可能是患者发生HBV-ACLF的风险等位基因。

表4 两组IFN-γ+2109A/G位点基因型和等位基因频率分布(%)比较

SNPACLF(N=60)对照组(N=60)x2OR(95%CI)P+2109A/G基因型AA32(53.3)40(66.7)AG11(18.3)14(23.3)6.5100.73(0.28～1.46)0.039GG17(28.3)6(10.0)等位基因A75(62.5)94(78.3)7.2210.75(0.61～1.84)0.007G45(37.5)26(21.7)

3 讨论

在我国，ACLF是最常见的肝衰竭类型，其中以HBV感染为病因的ACLF占绝大多数，可能系我国属于HBV高发地区的原因[15]。肝移植是目前最有效的治疗HBV-ACLF的方法，但其价格较为昂贵，且肝源无法满足广大患者的需求，且手术后需长期使用免疫抑制剂进行后续治疗，因此肝移植治疗的发展受到极大的限制。研究证明，早期发现并在合适的治疗时机对HBV-ACLF患者采取合理有效的治疗措施可大大缓解病情，甚至阻止疾病发展[7,8]。故及时准确地预测患者疾病进展的发生对降低HBV-ACLF发病率和病死率具有重要的临床意义。

细胞介导的免疫反应参与了病毒的清除和疾病的发生发展过程。IFN-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等细胞因子与ACLF患者肝细胞坏死和预后密切相关[16]。在人体对于HBV的免疫应答机制中，Th1细胞是主要的介导细胞，促进机体清除HBV，在这个过程中，容易激发肝组织炎症反应，诱发肝衰竭[17]。

IFN-γ是由巨噬细胞产生的细胞因子，可以活化T淋巴细胞，可激活单核巨噬细胞并诱导Th1细胞分化，使细胞毒性T淋巴细胞和效应T细胞活化，并通过活化的细胞毒性T细胞和效应T细胞杀灭病毒。鉴于IFN-γ在清除HBV过程中的重要作用，我们猜测IFN-γ水平与患者发生HBV-ACLF存在某种因果关系。随着对人类基因研究的不断发展，人们已经认识到不同的基因背景可以对不同人群和一些疾病产生影响。对于基因多态性的研究可以帮助我们了解不同基因型人群疾病发病率的不同，从基因水平去阐述HBV-ACLF的发病机制。近年来，细胞因子的基因多态性与疾病的易感性和临床转归的研究受到了广泛的关注。IFN-γ基因多态性与HBV感染有关[18,19]。IFN-γ基因位于人体第42号染色体上，跨度约为5.4 kb，由4个外显子和3个内含子组成[13]。IFN-γ+874T/A位点中TT基因型能促使人体产生高水平的IFN-γ，有助于人体对病毒感染的免疫防御，而TA和AA基因型的表达则会导致人体IFN-γ水平降低，增加了病毒感染的风险[20]。本研究发现，ACLF患者+874T/A位点TT基因型频率显著低于对照组，而A等位基因频率显著高于对照组，差异均具有统计学意义(P均<0.05)，提示+874T/A位点T等位基因是HBV-ACLF发生的保护性基因，而A等位基因是HBV-ACLF发生的风险基因。+874T/A和+2109A/G两个SNP位点的DNA序列均是NF-kB信号通路的特异性结合位点，可能影响人体IFN-γ的表达，且该通路受到影响还会导致氧化损伤，提示+2109A/G位点也与人体IFN-γ的表达有关。本研究关于+2109A/G位点的研究结果发现，ACLF患者AA基因型频率为53.3%，显著低于对照组的66.7%，且ACLF患者A等位基因频率为37.5%，显著高于对照组的21.7%，差异均具有统计学意义(P均<0.05)，验证了我们的猜想。