血清总胆固醇水平对机采血小板保存期间活化损伤的影响

蒋 靓，张光波，谢金晶，李维洁，汤龙海

（1.苏州市中心血站，江苏 苏州 215006；2. 苏州大学附属第一医院江苏省临床免疫研究所，江苏 苏州 215007）

血小板是哺乳动物血液中的有形成分之一，直径只有2～3 μm，是血液中最小的血细胞，其主要是骨髓成熟的巨核细胞质裂解形成的不规则碎片。血小板在体内发挥着重要作用，如止血凝血、炎症反应以及免疫应答等[1]。因此血小板输注在临床治疗中具有重要地位，机采血小板能够稳定血小板质量，提高采集效率以及增加安全性，但在(22±2)℃震荡保存的机采血小板保存期为5 d，随着保存时间以及暴露时间的增加，机采血小板的聚集水平以及活性损伤发生变化。相关研究表明，血清总胆固醇（TC）水平升高易导致动脉粥样硬化及相关疾病的发生[2]。本次研究旨在探讨体外胆固醇负载对机采血小板在保存期间的活化损伤影响，现将相关情况总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 拟纳入2019年4月—2019年6月苏州市中心血站无偿捐献机采血小板供者35 名，男性，年龄为25～40 岁。符合国家规定的献血者体检标准，同时满足以下要求：采前外周静脉血血小板达到(150～449)×109/L；2 次的采集间隔时间≥14 d；采集前72 h内未服用阿司匹林类药物。使用自动生化分析仪进行临床常规TC测定，根据血小板捐献者的血清TC水平分为两组：血清总胆固醇水平升高组（TC≥5.2 mmoL/L，n＝31）和血清总胆固醇水平正常组（TC＜5.2 mmoL/L，n＝4）。

1.2 方法 采用滤白法机采血小板，采用MCS+血细胞分离机和994E耗材（美国血液技术公司），选择LDPLP程序进行血小板采集。血小板采集设定量为≥2.5×1011/袋；血小板容量设定为250～300 mL；同时进行血小板质控检测，质量符合机采血小板国家质量标准。利用机采血小板的留样袋，每人份留取血小板10 mL，置于(22±2)℃水平震荡的血小板保存箱内保存，分别于第2、3、4、5天时，取出部分血小板使用小留样袋或EP管分装4 袋，室温下静置，分别于0、30、60、120 min留取血小板样本，进行流式细胞仪检测。流式细胞仪检测：用磷酸盐缓冲液调整血小板浓度为(1～3)×109/L的血小板悬液。同型对照组加入磷酸盐缓冲液各20 μL；测定管加CD63-FITC、CD36-PE、CD40-FITC、CD62p-PE各20 μL；取上述血小板悬液20 μL分别加入同型对照管和测定管，轻轻混匀，室温下避光孵育15 min；加入1 mL 4%多聚甲醛混匀，上机检测。

1.3 观察指标 分别于保存第2、3、4、5天进行两组血小板计数，并于0、30、60、120 min使用流式细胞仪检测血小板的CD63、CD36、CD40以及CD62p表达水平。观察比较两组不同血清TC水平下的血小板活化水平，其中包括CD63：血小板颗粒膜蛋白，为血小板的活化指标；CD36：血小板膜糖蛋白是磷脂酰丝氨酸的主要受体，广泛存在于血小板、脂肪粒细胞中，与血小板活化指标密切相关；CD40：与血小板活化呈正相关，是炎症相关因子，可以作为血小板活化的表面标志物；CD62p（P选择素）：血小板溶酶体膜糖蛋白，是血小板活化的表面标志物，能够准确反映血小板的活化程度[3]。

1.4 统计学方法 所有数据使用Excel软件和SPSS 11.0进行处理与统计，血小板的检测数据使用中位数表示；两组数据之间的比较采用非参数检验中的Wilcoxon检验，两组以上数据之间比较采用Friedman检验，若P＜0.05，表明差异具有统计学意义。

2 结果

血清总胆固醇升高组血小板在不同保存时间下的CD63、CD36、CD40以及CD62p的表达率同血清总胆固醇正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 两组血小板活性的比较

血清总胆固醇升高组血小板在不同暴露时间下的CD63、CD36、CD40以及CD62p的表达率与血清总胆固醇正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2～表5）

表2 两组血小板第2天活性的比较

表3 两组血小板第3天活性的比较

表4 两组血小板第4天活性的比较

表5 两组血小板第5天活性的比较

3 讨论

受到现有技术制约以及血小板具有特殊的分子结构，新鲜血液中分离出的血小板在22 ℃、60 次/min振荡条件下的存放时间仅为5 d，这种较短的保存时间极大地限制了临床上急需输血患者的急救。由于血小板在保存过程中因活化而黏附能力上升，国内外输血界一直关注血小板制备与保存的相关问题，亟待寻找导致血小板活化的相关负性调控因子[4]。活化血小板的表面标志物可以通过流式细胞仪检测到，不同于CD63在血小板的质膜中表达，CD62P是血小板活化过程中释放最多的颗粒膜上糖蛋白，在血小板的活化过程中其上升最为明显，较为容易检测到，一般作为血小板保存过程中最主要的质控指标之一。另外，CD36以及CD40/CD40L在血小板正常情况下基本不表达，只有血小板功能受损，质膜发生结构变化暴露出其糖表位才能够检测到其表达升高[5]。本次研究中设置不同暴露时间下，血小板活化能力的变化表明，在5 d保存期间内，血小板的活化水平没有显著上升，表明机采血小板在22 ℃、60 次/min振荡条件下能够一定程度上保留血小板的活性以及功能，维持其黏附结合能力，减少血源性疾病的传播，对于临床病人急救输注具有不可代替的作用。动脉粥样硬化以及与其相关的血栓等疾病的发生，例如中风、心肌梗死等疾病密切相关的是体内胆固醇水平升高[6-7]。研究发现，患有高脂血症的病人体内血小板的活化损伤水平、血小板炎症反应以及聚集水平明显增强，并且相关体外实验也表明，胆固醇水平过高容易导致血小板活化能力增强[8-10]。本次研究旨在表明，体外胆固醇负载对机采血小板在保存期间的活化损伤无显著影响。

本次研究表明，机采血小板的活性损伤与高TC水平无显著相关性，高TC水平的献血者提供的血小板在保存期间以及相关暴露时间下无明显活化聚集影响，可用于患者的临床输注。综上所述，在血小板保存期内，血小板在不同暴露时间下其活性变化无明显差异，不同TC水平的献血中，TC水平对血小板的活化水平无显著影响，在使用机采血小板进行输注时可以选择高水平TC的献血者提供的血小板，进而提高血小板采集范围和来源。