重组人血清白蛋白-硫氧还蛋白融合蛋白对流感病毒所致急性肺损伤小鼠的保护作用*

付南燕，徐 娟，韩晓群

（宜春学院医学院 1病原生物学教研室，2生理学教研室，江西宜春336000）

感染流感病毒可导致多种疾病，如急性肺损伤（acute lung injury，ALI），其具有较高的发病率和死亡率［1］。研究表明，氧化应激在流感引起的ALI的发生和发展中起着重要的作用［2-3］。硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）是一种小型氧化还原蛋白（12 kD），广泛存在于人体中，是多种氧化应激条件下诱导的防御蛋白之一［4］。然而，Trx血浆半衰期在小鼠中仅为1 h左右，在大鼠中仅为2 h［5-6］，为了获得满意的治疗结果，需要保持一定的Trx治疗浓度。为了增加Trx在血液中的保留时间，本实验利用毕赤酵母表达系统生产了一种由人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和Trx组成的基因重组融合蛋白HSATrx［7］。研究表明，在正常小鼠中 HSA-Trx融合蛋白的血浆半衰期与HSA相似，是Trx自身血浆半衰期的10 倍，此外，HSA-Trx在肺中的分布高于 Trx［7］。因此，本研究旨在探讨HSA-Trx对流感所致ALI小鼠的影响。

材料和方法

1 实验动物

60只SPF级5周龄健康雄性ICR小鼠，体重（31±1）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号为SYXK（沪）2016-0002；小鼠于12 h/12 h明暗循环、25℃和湿度（50±5）%的环境中，接受标准摄食和饮水，自适应饲养1周。

2 主要试剂

蓝色琼脂糖凝胶6FF、HiTrap Phenyl HP柱和PD-10脱盐柱（GE Healthcare）；Diff-Quick试剂（Solarbio）；考马斯亮蓝染色液、4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA试剂盒（BioLegend）；水合氯醛、4%甲醛、Mayer苏木精溶液和1%伊红醇溶液（Sigma）；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）抗体（Santa Cruz）；3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，NO2-Tyr）抗体（Millipore）。

3 方法

3.1 HSA-Trx融合蛋白的产生 利用毕赤酵母表达系统生产了基因重组融合蛋白HSA-Trx［7］。将转化后的巴斯德毕赤酵母细胞在1.25 L BMGY液体培养基［1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾（pH 6.0），1.34%硫酸铵作为酵母氮源（无氨基酸），0.000 04%生物素，1%甘油］（增长阶段）中培养2 d（A600=2），然后在30°C含有蛋白表达诱导剂和甲醇碳源的800 mL BMMY培养基［1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾（pH 6.0），1.34%硫酸铵作为酵母氮源（无氨基酸），0.000 04%生物素，1%甲醇］（蛋白质诱导阶段）中培养3 d。每隔12 h加入甲醇，使甲醇浓度保持在1%，以维持蛋白表达诱导效应。融合蛋白在蓝色琼脂糖凝胶6FF柱上用200 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.5）进行色谱纯化，透析后在相同缓冲液上平衡。采用蛋白纯化仪，5 mL Hi-Trap Phenyl HP柱上进行疏水层析，采用以下条件：缓冲液A：50 mmol/L Tris-HCl/1.5 mol/L硫酸铵（pH 7.0）；缓冲液B：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）；梯度：0～100%缓冲液B 100 mL；流速：3 mL/min。融合蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝R250染色。该融合蛋白的纯度可达97%以上。

3.2 ALI小鼠模型的建立及实验分组 本实验使用的小鼠H1N1流感病毒PR8株（A/Puerto Rico/8/1934）由中国医学科学院医学生物研究所提供，-80℃保存。将小鼠随机分为4组：健康对照（control）组、ALI组、ALI+Trx组和ALI+HSA-Trx组，每组10只。除健康对照组外，其余处理组小鼠在第0天使用水合氯醛（500 mg/kg）麻醉，流感病毒悬液鼻内接种，剂量为1.5×LD50（用LB培养液稀释流感病毒悬液），建立流感诱导的ALI小鼠模型。Trx或HSA-Trx组在病毒感染后第4天和第6天经小鼠尾静脉注射Trx或HSATrx（每只小鼠3.5 nmol蛋白，溶于200 μL生理盐水中），健康对照组和ALI组小鼠注射200 μL生理盐水。分别于相应时点处死小鼠，其中第0天于感染后2 h处死小鼠取材，进行疗效评价。生存率分析另外取小鼠进行ALI组和ALI+HSA-Trx组实验，从病毒感染第0～14天，每组10只，这些小鼠未测量其它参数。

3.3 肺灌洗样本分析 乙醚麻醉小鼠，打开胸腔，取血测定过氧化物（见下文）。气管插管，用1 mL含5×104U/L肝素的无菌PBS灌肺（2次），收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar larage fluid，BALF）。每只小鼠体内提取约1.8 mL BALF，混匀后取0.5 mL用血细胞计数器计算细胞总数。剩余BALF离心（250×g、10 min、4°C），弃上清液，在 0.9%NaCl中重悬细胞，用Diff-Quick试剂染色细胞，测定肺泡中性粒细胞数量。以BSA为标准品，采用考马斯亮蓝溶液法测定BALF中的蛋白浓度。采用ELISA法测定BALF中IFN-γ的含量。

3.4 肺组织的病理学检查 将肺组织固定于4%甲醛，石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，观察病理学变化，采用免疫荧光法检测iNOS、8-OhdG和NO2-Tyr。采用HistoVT One进行抗原检索，用含有50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）和0.1%吐温 20（T-TB）的溶液对肺切片进行溶解，在25℃用下BlockAce封闭15 min，加入I抗，4℃下过夜。此外，使用前用0.5%BSA在PBS中稀释（1∶50）I抗，并与DAPI溶液（10 g/L）偶联。用T-TB冲洗肺切片，25℃下与II抗反应1.5 h。iNOS和NO2-Tyr免疫染色采用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H+L）（Invitrogen），8-OHdG免疫染色采用Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（H+L）（Invitrogen），使用前在PBS中用0.5%BSA稀释（1∶2 000）。反应后，在显微镜下观察切片。利用ImageJ软件对iNOS、8-OHdG和NO2-Tyr免疫荧光染色的程度和强度进行图像分析。

3.5 血浆过氧化物水平的测定 于腹主动脉采血3 mL，并立即于 4℃、1 000×g离心 15 min，收集血浆，-80℃保存。使用CR2000RC分析仪测量血浆中过氧化物浓度。测量单位为U.CARR（Carratelli unit；1 U.CARR相当于0.8 mg/L过氧化氢）。

3.6 肺组织病毒载量测定 取流感病毒感染小鼠的左肺，称重，在1 mL RPMI-1640培养基中进行匀浆处理，100×g、4℃离心10 min，取上层清液，通过Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）细胞空斑形成实验测定病毒滴度。将MDCK细胞接种于24孔板上，培养至融合。PBS冲洗，每次稀释0.1 mL接种至培养细胞，34℃孵育1 h。每孔加入DMEM 0.5 mL（含青霉素1×105U/L、链霉素100 mg/L和两性霉素B 0.5 mg/L），在5%CO2、37℃加湿培养箱中培养3 d。计算病毒斑，采用Reed和Muench公式计算50%组织培养感染剂量（median tissue culture infectious dose，TCID50）［8］。

3.7 FITC标记HSA-Trx评价其在流感病毒感染小鼠BALF中的分布 HSA-Trx（4 g/L）和FITC（1 g/L）溶于0.15 mol/L K2HPO4（pH 9.5）中，室温下混合4 h，经PD-10脱盐柱脱盐，洗脱液用Vivapore浓缩。病毒感染后第4天和第6天给模型小鼠静脉注射FITC标记的HSA-Trx（每只3.5 nmol），正常小鼠第0天给药，2 h后，用乙醚麻醉小鼠，打开胸腔，抽肺内干血液。气管插管，用1 mL含5×104U/L肝素的无菌PBS灌肺，收集BALF。每只小鼠体内提取约0.8 mL BALF。BALF在250×g、4℃离心10 min，将BALF中的细胞从液体中分离出来，采用分光光度计检测BALF中FITC标记的HSA-Trx含量。

4 统计学处理

计量数据表示为均数±标准差（mean±SD）。使用GraphPad Prism 7.0进行统计分析。单因素方差分析（one-way ANOVA）和Bonferroni多重比较分析各组间的差异。使用Kaplan-Meier对数秩检验分析生存曲线。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 HSA-Trx对流感病毒感染小鼠体重及存活率的影响

气管内注射1.5×LD50剂量流感病毒可引起小鼠急性肺损伤，BALF中的总细胞数增加、中性粒细胞的浸润和总蛋白含量升高在病毒感染后的第4～6天发生，见图1A～C。此外，流感病毒感染后病毒载量在第4天达到高峰后下降，见图1D。

ALI组小鼠的体重从病毒感染后第6天开始下降，病毒感染后第14天，仅20%小鼠存活，而HSATrx给药显著抑制了病毒感染小鼠体重的下降（P＜0.05），在病毒感染后14天，70%的HSA-Trx治疗小鼠仍然存活，存活率显著高于ALI组小鼠（P＜0.05），见图2。

2 HSA-Trx对流感病毒感染小鼠损伤的相对抑制作用

HSA-Trx处理小鼠后其BALF中总细胞数显著低于ALI组和Trx组的小鼠，中性粒细胞数显著低于ALI组小鼠（P＜0.05），见图3A、B，HSA-Trx显著降低了ALI小鼠BALF中的蛋白浓度（P＜0.05），而Trx对降低BALF蛋白浓度没有显著作用（P＞0.05），见图3C。

HE染色的肺切片显示，与ALI组相比，HSA-Trx处理后肺切片的损伤程度有所减轻（P＜0.05），Trx处理组肺切片的组织病理学结果与ALI组相似，见图3D。

3 HSA-Trx对BALF中IFN-γ水平及肺中iNOS表达的影响

与健康对照组相比，ALI组小鼠的IFN-γ和iNOS表达水平升高（P＜0.05），而HSA-Trx处理后与ALI组之间没有显著性差异（P＞0.05），见图4。

4 HSA-Trx对肺组织氧化应激的影响

与健康小鼠相比，流感病毒感染小鼠肺组织中8-OHdG和NO2-Tyr表达及血浆过氧化物水平均升高（P＜0.01），而HSA-Trx则显著抑制了这些氧化应激标志物的表达（P＜0.05），见图5。

5 在流感病毒感染小鼠BALF中FITC标记的HSA-Trx的分布

Figure 1.Evaluation of influenza virus-induced ALI model mice（0，2，4，6 and 8 days after viral infection）.A：total cells in BALF；B：neutrophils in BALF；C：protein concentration in BALF；D：viral titers in lung tissues.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs day 0.图1 流感病毒诱导的ALI模型小鼠的评估

Figure 2.Effect of HSA-Trx on body weight（A）and survival rate（B）of mice infected with influenza virus.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs ALI group.图2 HSA-Trx对流感病毒感染小鼠体重和生存率的影响

第6天FITC标记的HSA-Trx在BALF的分布大约是正常小鼠第0天的4倍（P＜0.01），见图6。

讨 论

Trx对氧化应激相关或炎症相关的肺部疾病具有有效作用［9］，流感病毒感染是造成肺炎的原因，并伴有ALI等并发症，可能导致死亡［1］。本研究表明HSA-Trx对流感病毒所致的ALI小鼠有一定保护作用。本研究利用甲型流感病毒H1N1诱导ALI，且在流感病毒感染后的病毒载量在第4天达到峰值，然后下降。因此，HSA-Trx在病毒感染后第4和6天用，显著降低了小鼠死亡率。结果与以前的报道一致［9］，该研究中重组蛋白Trx-1提高了病毒感染小鼠的存活率。BALF中总蛋白的增加可以评估感染引起的ALI的严重程度［10］，本研究中HSA-Trx显著降低了ALI小鼠BALF中流感病毒诱导的总蛋白含量，而Trx则没有显示出疗效。此外，从病理学上证实了HSA-Trx改善了小鼠H1N1诱导的肺损伤。与本研究结果类似，Trx对博来霉素诱导的肺损伤没有显示有效的保护作用［11］。因此，HSA-Trx的保护作用可能是与其在血液中滞留的时间延长有关［5-6］。

Figure 3.Relative inhibition of HSA-Trx in mice infected with influenza virus（8 days after virus infection）.A：total cells in BALF；B：neutrophils in BALF；C：protein concentration in BALF；D：lung histopathology（HE staining，scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs ALI group.图3 HSA-Trx对流感病毒感染小鼠肺损伤的作用

Figure 4.Effect of HSA-Trx on IFN-γ levels in BALF and expression of iNOS in lung tissue of mice infected with influenza virus（8 days after virus infection）.A：IFN-γ levels in BALF；B：iNOS/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图4 HSA-Trx对流感病毒感染小鼠BALF中IFN-γ水平和肺组织中iNOS表达的影响

Figure 5.Effect of HSA-Trx on oxidative stress in mice infected with influenza virus.A：8-OHdG/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）；B：NO2-Tyr/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）；C：plasma peroxide levels.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ALI group图5 HSA-Trx对流感病毒感染小鼠氧化应激的影响

研究表明，流感病毒感染导致BALF中产生了大量IFN-γ，从而导致肺泡巨噬细胞、支气管和肺泡上皮细胞中iNOS表达上调［12］。但本研究中HSA-Trx并不能降低因病毒感染而产生的IFN-γ和iNOS表达水平。其他研究表明，活化的白细胞，尤其是肺泡巨噬细胞和中性粒细胞释放的ROS与流感诱导的ALI有关［2］。研究还显示BALF中的中性粒细胞浓度与肺部疾病严重程度呈正相关［13］。本研究中HSA-Trx对病毒感染引起的中性粒细胞的浸润有显著的抑制作用。事实上，中性粒细胞在流感病毒感染后到达肺泡，与白细胞（例如肺泡巨噬细胞）结合。此外，iNOS释放的NO与活化的白细胞生成的·O2-反应可以产生具有强损伤活性的ONOO-，ONOO-可以硝化多种生物靶点，如蛋白质和脂肪酸，产生NO2-Tyr加合物［14］。本研究中HSA-Trx显著抑制了肺组织中8-OHdG和NO2-Tyr的表达及血浆过氧化物这些氧化应激标志物的表达。此外，研究报道Trx通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶活化、L-选择素下调和内皮细胞粘附，对中性粒细胞产生抗趋化作用［5］。因此，HSA-Trx对流感诱导ALI的改善作用机制不仅与抗氧化作用有关，可能还涉及到抗趋化作用。

肺泡液体中白蛋白的浓度通常远低于血液中，然而在肺损伤的情况下，由于表面活性剂表面张力显著升高而导致血管高通透性，蛋白浓度可增加到血浆水平的75%～95%［15］。因此，BALF中白蛋白浓度在临床上被用作肺损伤的生物标志物。本研究结果表明HSA-Trx可明显降低流感病毒感染小鼠的BALF中蛋白的浓度。

Figure 6.Distribution of FITC-labeled HSA-Trx in BALF of influenza virus-infected mice.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs day 0.图6 FITC标记的HSA-Trx在流感病毒感染小鼠BALF中的分布

综上所述，HSA-Trx是一种持久的抗氧化剂和抗炎调节剂，其给药后能抑制流感病毒诱导的ALI，其机制可能是其抗氧化和抗趋化的共同作用，另外HSA-Trx在病变部位的分布有所不同，即在流感感染者肺间质的分布可能高于健康人。因此，HSA-Trx治疗流感病毒引起的肺炎可能具有相当大的潜力。