神经重症监护室中肺炎克雷伯菌的流行病学特征研究

刘妍，张萍淑，2，乔思佳，李佳慧，郑慧，元小冬，2

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是引发各种 类型医院感染和社区感染的主要病原菌，其在病房环境中具有较强的传播和定植能力［1-2］。神经重症监护室（neurological intensive care unit，NICU）患者多伴有意识障碍，因其病情危重并接受侵入性操作等而成为院内感染的高危人群，其中KP是NICU患者院内感染的常见致病菌［3-4］。近年临床感染控制部门常采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术、多位点序列分型（MLST）等检测KP，其中PFGE技术是检测KP同源性的“金标准”。本研究通过PFGE技术检测NICU感染患者和病房环境中分离KP间的同源性，进而了解NICU中KP传播途径，指导NICU制定科学合理的环境消毒措施，切断其传播途径，有效控制KP传播，降低NICU患者KP感染发生风险。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015—2018年在华北理工大学附属开滦总医院NICU住院的KP感染患者93例，均符合《医院感染诊断标准（试行）》［5］中的KP感染诊断标准。纳入标准：（1）体温≥38.0 ℃且持续时间≥2 d；（2）血常规检查显示白细胞计数及中性粒细胞数目异常改变，影像学检查结果示肺部炎性浸润性改变；（3）存在呼吸道急性炎症，并伴恶心呕吐、腹痛/腹泻等消化系统症状；（4）明显尿道刺激征、下腹触痛、肾区叩击痛，且尿常规检查示白细胞计数异常升高（男性≥5个/高倍视野，女性≥10个/高倍视野）。排除标准：（1）因流行性感冒、过敏及其他急性传染病等非感染因素导致呼吸系统炎症表现者；（2）因急性传染病等其他疾病引起的发热、恶心呕吐、腹泻等感染症状者。所有患者中，男56例、女37例，平均年龄（69.4±2.4）岁。本研究经华北理工大学附属开滦总医院医学伦理委员会审查批准，且所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 KP感染患者KP采集 留取KP感染患者标本（包括痰、血、尿、便、分泌物等）进行KP检测。

1.2.2 床单位环境KP采集 在患者确诊KP感染24 h内对其床单位环境（包括病床周围空气、枕头、被子、床头柜等）进行KP检测并采集标本。

1.2.3 NICU病房环境KP采集 NICU病房分为大房间（6人间）、小房间（2人间），分别于每个月第2、4周周二上午9：00～10：00对大、小房间的病房环境进行常规检测并采集标本。对标本进行分离培养及菌株鉴定，并将分离的KP菌株置于-20 ℃环境中保存备用。

1.3 KP同源性检测方法 将KP感染患者及其床单位环境、NICU病房环境中分离的KP菌株接种于中国蓝培养基，并将培养基置于35 ℃的CO2培养箱内培育24 h，而后经过KP DNA的提取、细菌的胶块包埋、细胞的裂解、胶块的清洗、胶块内DNA的酶切、制胶与上样等步骤后进行PFGE，最后采集图像并保存。PFGE图像数据采用BioNumerics（Version 7.1，Applied maths，Inc.）软件包进行处理，识别图像条带（出现不同条带即判定为成功分型），不同菌株条带相似性系数用Dice系数（Dice coefficients，SD）表示，根据每两个图像间的相似性系数采用非加权配对算术平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）进行聚类分析并构建聚类树。以相似度为100%为同一克隆株，相似度≥80%为同一流行克隆株作为标准［6］。

1.4 统计学方法 采用Excel 2007软件建立数据库并进行描述性分析。

2 结果

2.1 KP采集结果 93例KP感染患者中，分离出KP 94株；患者所在床单位环境分离出KP 13株，包括病床周围空气8株、患者被子2株、患者枕头1株、患者床头柜1株、空气1株。KP同源性PFGE聚类分析见图1。

2.2 KP感染患者及其床单位环境的关系 KP感染患者及其床单位环境分离的107株KP中，仅4株（菌株编号分别为1508、1518、1711、1810）PFGE图像条带未出现，故103株成功分型并可分为85个型别。聚类分析结果显示，KP感染患者与其床单位环境同源性100%的KP 15组，其中23例KP感染患者KP 24株，其中1例咽拭子/血、痰培养分别培养出不同的KP，23例患者基本情况见表1，KP感染患者及其床单位环境同源性为100%的KP菌株情况见表2；床单位环境KP 9株。

表1 NICU同源性100%的KP感染患者基本情况（n=23）Table 1 Basic situation of patients with KP infection with 100% homology of NICU

2.3 同源性100%的KP感染患者入住NICU时间间隔 同源性100%的15组KP感染患者中，第1组患者入住NICU时间间隔22 d，第2组为29 d，第3组为31 d，第4组为患者与其周围空气，第5组为患者与小房间空气，第6组为15 d，第7组为3 d，第8组为117 d，第9组为同一患者痰培养、咽拭子检出的KP；第10组为患者与其枕头；第11组为95 d，第12组为8 d，第13组为10 d，第14组为患者周围空气与床头柜，第15组为患者周围空气与被子。

3 讨论

NICU患者是医院感染的高危人群，而KP是导致感染的主要致病菌［7］。PFGE是研究分子流行病学的一种技术，通过分析菌株间同源性以较好地了解菌株间的亲缘关系，有助于寻找疾病传播途径，便于制定预防交叉感染的有效策略。研究表明，同一型别菌株可能存在流行病学关联［8-9］。

图1 NICU KP同源性PFGE聚类分析图Figure 1 KP homology PFGE cluster analysis chart in NICU

PFGE技术作为同源性检测的金标准，是目前临床研究细菌间相关性应用最广泛的技术，可用于研究菌株间的遗传差异、追踪传染源、进行分子流行病学研究等［10］。PFGE技术先提取菌株染色体，再用琼脂块进行包埋，细菌染色体用特异性内切酶进行酶切，由于酶切后的染色体DNA大小不同，因此其在交替改变的电场中电泳速度也不同，故表现为不同的条带［11］，通过比较条带的数目、位置可以了解菌株间的同源性。本研究通过收集NICU中KP，采用PFGE技术分析菌株间的同源性，进一步了解NICU中KP的流行病学特征，以为NICU重症患者KP感染的防控提供科学合理的理论指导。

本研究结果显示，KP感染患者与其床单位环境同源性100%的KP 15组，2018年2例感染患者1819、1820（P90、P91）和其中1例感染患者周围空气中检出的KP 1824（PA9）为同一克隆株，这2例患者入住NICU时间间隔为22 d；2018年2例感染患者1814、1817（P85、P88）入住NICU时间间隔为29 d；2018年2例感染患者1806、1807（P77、P78）入住NICU时间间隔为31 d；2015年2例感染患者1526、1528（P26、P28）与其中1例感染患者周围空气中检出的KPB1（P26B）为同一克隆株，这2例患者入住NICU时间间隔为15 d；2015年2例感染患者1513、1501（P13、P1）入住NICU时间间隔为3 d；2015年2例感染患者1520、1525（P20、P25）入住NICU时间间隔为117 d；2016年3例感染患者1603、1610、1619（P32、P39、P48）入住NICU时间间隔为95 d；2016年2例感染患者1612、1613（P41、P42）入住NICU的时间间隔为8 d；2016年2例感染患者1623、1624（P52、P53）入住NICU时间间隔为10 d；2017年1例感染患者1712（P66）与其周围空气中1719（PA7）检出的KP为同一克隆株；2015年1例感染患者1527（P27）与小房间空气中A3（PAX）检出的KP为同一克隆株；2015年同一感染患者痰培养1521T（P21T）、咽拭子1521Y（P21Y）检出的KP为同一克隆株；2015年1例感染患者1529（P29）和其枕头上Z1（P29Z）检出的KP为同一克隆株；2015年1例感染患者周围空气A2（PZA）和床头柜T1（PZT）中检出的KP为同一克隆株，2015年1例感染患者周围空气A4（PA4）和被子中B2（PB2）检出的KP为同一克隆株。本课题组既往研究结果表明，KP是NICU的主要致病菌，具有极强的定植和传播能力，并对NICU环境微生物定植分布特征及影响因素与医院感染的关系进行了系统研究［3，12］。本研究结果进一步表明，患者感染的KP与其环境中检出的KP同源性为100%，表明KP可通过空气、枕头、被子等途径导致患者感染。另外，本研究结果还显示，患者入院时间不同，但检出KP可为同一克隆株，表明KP可在环境中长期定植，且最长可在NICU环境中定植117 d，因此为病房环境有效消毒极其重要。

同源性100%的KP中共包括23例KP感染患者KP 24株，床单位环境KP 9株，同源性100%患者入住NICU最长时间间隔117 d，表明KP可在患者枕头、被子、床头柜等床单位环境中定植，并可在病房环境中生存长达4个月左右，进一步造成其他住院患者感染，因此要对KP医院感染高风险的患者进行定期监测，实施严格的消毒隔离措施，临床诊疗过程中要增强对重症易感患者的管理［13-15］，加强医院感染监测、强化病房环境的消毒，切断KP的传播途径［16-18］，才能有效控制NICU中患者KP感染［19-20］。研究表明，空气传播是患者感染KP最常见途径，住院时间越长，患者感染率越大，使用抗生素的时间越长、种类越多，且易合并其他细菌感染。因此，在临床工作中可针对其可能的危险因素加强预防措施和操作过程管理、规范抗菌药物临床使用，对KP感染患者早发现早隔离并给予合理的抗感染治疗，进而预防和减少KP传播［21-22］。

综上所述，KP是NICU常见致病菌，而空气传播是其主要传播途径，并可在NICU空气中定植4个月左右，且枕头、被子等也可传播KP，因此加强感染患者和病房环境监测，及时消毒以切断KP传播途径，有效防控其传播与流行；但本研究仅针对NICU患者，且为单中心研究，今后可联合冠心病重症监护室（CCU）、呼吸重症监护室（RCU）等科室及多中心共同研究，以更全面地了解KP定植及其传播特征。

作者贡献：刘妍、张萍淑进行文章的构思与设计，论文的修订；元小冬进行研究的实施与可行性分析，对文章整体负责，监督管理；刘妍、乔思佳、李佳慧、郑慧进行数据收集、整理、分析；刘妍进行结果分析与解释，撰写论文；张萍淑负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。