基于中医代谢组学特征探讨参苓白术丸联合黄芪颗粒干预肺纤维化的作用机制

刘洋， 郑彩霞， 韩金花， 孙丰云， 于盼， 张念志

（1.淮北市中医医院，安徽淮北 235000；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥 230031）

肺纤维化是一类以炎症细胞浸润、成纤维细胞沉积并伴有肺组织结构破坏为特征的弥漫性病变，既往多从信号通路、炎症因子等角度对其进行了探讨[1]。基于中医整体观念的益气健脾疗法的机制研究已经广泛地运用到防治肺纤维化这一慢性疾病当中，但中医药的研究需要多视角、系统地、综合地进行机制研究。代谢组学研究方法包含机体生物代谢的整体信息，与中医学的“整体观”和“生态医学观”非常吻合，为中医“证候”本质的研究拓展了新思路，是中医证候研究的重要方法[2-3]。为此，我们采用代谢组学技术，将肺纤维化肺脾气虚证患者与健康人群对比，寻找肺脾气虚证的潜在证候标志物，并观察参苓白术丸联合黄芪颗粒治疗肺纤维化肺脾气虚证患者血浆中潜在证候标志代谢物的变化，推测其体内生化过程和状态的变化，揭示参苓白术丸联合黄芪颗粒治疗肺纤维化肺脾气虚证的作用机制，利用代谢物的终端性信息，为寻找药物作用的靶点或受体提供临床指导。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2018 年5 月至2019 年1 月在淮北市中医医院门诊就诊的23 例肺纤维化肺脾气虚证患者作为肺纤维化组，另选取20 例健康体检者作为对照组，所有受试者均自愿签署知情同意书。

1.2 诊断标准西医诊断标准:参照2011年特发性肺纤维化（IPF）诊断和治疗循证新指南[4]。中医证候标准:参照《中药新药临床研究指导原则》[5]和《中医内科学》[6]中的有关内容，中医证型为肺脾气虚型。主要症状:喘息，咳嗽，胸闷气短，畏风寒，纳差乏力，易汗出或自汗，舌淡苔白，脉浮。

1.3 纳入标准①符合上述疾病诊断标准及中医证候诊断标准，且1 个月内未使用其他药物治疗；②年龄在45～65 岁；③处于肺纤维化稳定期；④自愿参加本研究并签署知情同意书的患者。

1. 4 排除标准①有明确职业病史（尘肺、矽肺）、药物史（胺碘酮）等原因引起的肺间质性疾病患者；②有严重心肝肾功能损害的患者；③有其他严重疾病的患者；④依从性差，未按规定接受治疗，从而影响疗效判定的患者。

1.5 治疗方法

1.5.1 治疗组 给予参苓白术丸联合黄芪颗粒治疗。（1）参苓白术丸（主要成分:人参、炒白术、陈皮、茯苓、山药、砂仁、桔梗等；由河南宛西制药有限公司生产， 批准文号: 国药准字Z8121003），口服，每次4 丸，每日3 次。（2）黄芪颗粒（贵州汉方药业股份有限公司生产，批准文号:国药准字Z19993254），冲服，每次2 袋（每袋相当于中药饮片黄芪15 g），每日2 次，2 个月为1 个疗程。

1.5.2 对照组 不给予任何干预治疗。

1.6 观察指标与标本检测

1.6.1 中医证候评分 参照《中药新药临床研究指导原则》[5]，结合临床实际制定。主要包括喘息、咳嗽、自汗、乏力等4 项，根据程度分为无、轻、中、重4级，分别计为0、1、2、3分。

1.6.2 标本检测方法

1.6.2.1 标本采集 对照组抽取静脉血4 mL，肺纤维化组于治疗前和治疗后各抽取静脉血4 mL，2 组血液样本以3 000 r/min的速度离心15 min（温度小于4 ℃），取上清液留存于-70℃冰箱待用。

1. 6. 2. 2 标本制备 检测前将所有血浆样本4℃解融，乙腈、蒸馏水预冷8 h。乙腈/血浆样本为3∶1比例（3 000 μL/1 000 μL）进行蛋白沉淀，涡旋混匀；以15 000 r/min 离心10 min，取上清液，与乙腈、蒸馏水按1∶1∶3稀释，移入液相瓶中待测。

1.6.2.3 样本质量控制 各组样本4 ℃解融，涡旋混匀，分别吸取100 μL 血清，再次涡旋混匀后分装于EP管中。其余处理同本方法。

1.6.2.4 液相色谱—质谱联用（HPLC-MS）检测 在安徽中医药大学第一附属医院中药药理实验室采用HPLC-MS 和AB SCIEX Q-Triple 4500 System检测分析。色谱柱:Shim-pakISC-07/S1504Li（150 mm × 4.0 mm）；流速:0.5 mL/min；进样量:10 μL；柱温:40 ℃；流动相:A:将蒸馏水和乙腈按照19∶1 的比例配置，并加入600 μL 乙酸溶液和5 mL 乙酸铵。B:将乙腈和蒸馏水按照19∶1 的比例配置，并加入600 μL 乙酸溶液和5 mL 乙酸铵。梯度洗脱条件如下:先加入2%乙腈，20 min内增加至95%乙腈，在2 min 内降至3%并维持5 min，后运行时间设为5 min；流速为0.5 mL/min；样本体积为5 μL。

1. 6. 2. 5 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI）正离子模式检测，质谱检测范围:质荷比（m/z）100 ～1 200 Da；CUR:40.0 psi；CAD High Ion Spray VoHage: 5 000 V；DP:80 V；EP:20 V；CE:10 eV；TEM:600 ℃。

1.7 统计方法及数据处理

1.7.1 统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据的统计处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t 检验；计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.7.2 数据处理 （1）本研究采用美国AB 公司的markerview 1.2.1 代谢组学分析软件对归一化的数据进行自动建模分析，输出形式为载荷图[7]。载荷图中的每一个点表示一个代谢区域，处于病理状态的样本在散点分布处于相似的位置；载荷图上每一个点表示代谢物的相关信息，距离原点越远，表示其病理生理状态差距越大，对不同组间的分离贡献亦越大[8]。（2）利用SIMCA V14.1 代谢组学分析软件，对数据进行主成分分析（PCA）正交偏最小二乘法—判别分析（OPLS-DA），最大化显示模型与主成分相关差异。利用OPLS-DA 模型变量因子（VIP＞1，t 检验，P＜0.05）的条件进行质荷比筛选和寻找差异性代谢物，通过检索数据库（http://metlin.scripps.edu/、www.hmdb.ca/metabolites、KEGG、LIPID）定性可能的差异代谢物，推测代谢物种类，对差异性代谢物进行分析，从而找到与代谢差异物相关性最高的通路所在。

2 结果

2.1 肺纤维化组与对照组的基线资料比较肺纤维化组23 例受试者中，男14 例，女9 例；年龄56～65 岁，平均（58.06±6.82）岁。对照组20 例受试者中，男15 例，女5 例；年龄51～63 岁，平均（53.06±7.82）岁。2 组受试者的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 肺纤维化组患者治疗前后各项中医证候评分比较表1 结果显示:治疗2 个月后，肺纤维化组患者喘息、咳嗽、自汗、 乏力评分均较治疗前明显改善，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表1 肺纤维化组患者治疗前后各项中医证候评分比较Table 1 Comparison of TCM syndrome scores in the case group before and after treatment（±s，s/分）

表1 肺纤维化组患者治疗前后各项中医证候评分比较Table 1 Comparison of TCM syndrome scores in the case group before and after treatment（±s，s/分）

①P＜0.01，与治疗前比较

时间治疗前治疗后N/例23 23喘息2.95±1.34 0.11±0.03①咳嗽1.95±0.61 0.37±0.22①自汗2.05±0.52 0.83±0.41①乏力2.05±0.66 0.71±0.57①

2.3 肺纤维化组患者治疗前后和对照组的血浆代谢物PCA 图PCA 图能反映各组样本代谢差异和组内样本之间的变异度大小。分析模型参数为R2X，其值大于0.4 表示可靠。2 组共计获得8 个主要成分，共计R2X=0.652。从图1 可看出，肺纤维化组与对照组代谢物分别处于不同区域，有显著性差异。

图1 肺纤维化组治疗前后和对照组的血浆代谢物PCA图Figure 1 PCA results for the plasma differential metabolites in the case group before and after treatment and in the control group

2.4 肺纤维化组患者治疗前后和对照组的血浆代谢物OPLS载荷图采用OPLS对2组样本获得差异性代谢物信息，模型参数:R2X 值为0.473，R2Y值为0.983、Q2值为0.876，提示该模型稳定且可信度高。图2 载荷图中的圆点（X）代表了所有差异性代谢物，载荷图左右两端的物质是潜在的差异标志物。距离蓝色三角（Y）越近，其变异量也越大，而这些大的变异量在样本分类中起决定性的作用。治疗后肺纤维化组代谢物同对照组融合交织，与治疗前相比差异显著，结果见图3。

图2 肺纤维化组治疗前和对照组的血浆代谢物OPLS载荷图Figure 2 OPLS load chart for the plasma differential metabolites in the case group before treatment and in the control group

图3 肺纤维化组治疗后和对照组的血浆代谢物OPLS载荷图Figure 3 OPLS load chart for the plasma differential metabolites in the case group after treatment and in the control group

2.5 潜在证候标志代谢物治疗前后变化趋势结合重要变量因子VIP值，借助（KEGG、LIPID）等相关数据库，经t 检验选出差异变量，通过对肺纤维化组治疗前后差异性代谢物，推测出在正离子模式下，磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、基质金属蛋白酶1、白三烯4、脂氧素15-epi-LXB4、15-羟基二十碳四烯酸6种物质为肺纤维化组干预后的差异性代谢物。表2 显示肺纤维化组治疗后磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4 等成分较治疗前下降，趋向于健康对照组水平。

表2 潜在证候标志代谢物变化趋势Table 2 Tendency of the changes in the potential syndrome marker metabolites

2.6 肺纤维化组治疗前后与对照组血浆差异性代谢物的代谢通路如图4所示，每一个气泡代表一个代谢通路，气泡所在横坐标和气泡大小表示该通路在拓扑分析中的影响因子大小，气泡越大影响因子越大；气泡所在的纵坐标和气泡颜色表示富集分析的P 值（-log10P-value），颜色越深，P 值越小，富集程度越显著。如图4、5 所示，肺纤维化组治疗前所涉及的主要异常代谢通路为神经酰胺酶代谢、磷脂酶代谢、谷胱甘肽代谢、α-亚麻酸代谢、鲨烯代谢、二十四烷酸代谢；治疗后的代谢通路为神经酰胺酶代谢、磷脂酶代谢。

图4 肺纤维化组治疗前与对照组血浆差异性代谢物的代谢通路图Figure 4 The main metabolic pathways of plasma differential metabolites in the case group before treatment and in the control group

图5 肺纤维化组治疗后与对照组血浆差异性代谢物的代谢通路图Figure 5 The main metabolic pathways of plasma differential metabolites in the case group after treatment and in the control group

3 讨论

肺纤维化治疗缺乏特效药物，目前大多采用糖皮质激素或联合细胞毒药物治疗，存在一定的不良反应，而中医药以其多成分、多靶点的作用特点，在提高疗效、改善生活质量、减轻毒副作用上有较好疗效。肺纤维化属中医“肺痿”范畴，是由于肺气虚弱、气不布津而导致的以咳吐浊唾涎沫为主症的一类疾病，研究[9]证实其基本证型以肺气虚证为主，治疗也多以益气为主，再结合辨证给予化痰健脾祛湿为法。参苓白术丸出自宋代《太平惠民和剂局方》，具有益气健脾、祛湿之功效，为“培土生金”治法的常用方剂；而黄芪具有补肺气之功效。现代药理研究表明，方中的主要成分人参皂苷具抗疲劳、增强机体免疫功能作用[10]；而黄芪颗粒中的黄芪多糖能升高白细胞，提高网状内皮系统功能，激活T 细胞、自然杀伤（NK）细胞等免疫细胞活性[11]。本研究结果显示，肺纤维化组患者治疗后的各项中医证候评分均较治疗前明显改善，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明参苓白术丸联合黄芪颗粒能显著改善肺纤维化患者肺脾气虚证的临床症状。

中医方剂对应的是证候或病，发现证候/病的生物标志物，建立临床疗效的生物评价体系是评价方剂临床疗效进而发现中药药效物质基础的基本前提[12]。中医方证代谢组学以中医证候/病的本质研究为起点，通过方剂内显效成分和相关代谢标志物的关联性，从而为深入了解疾病的发病过程提供理论依据，为疾病诊断及评价药物疗效提供指导，是体现中药复方配伍的有效性方案[13]。张淼等[14]研究发现人类免疫缺陷病毒感染导致的获得性免疫缺陷综合征（HIV/AIDS）肺脾气虚证患者存在脂代谢异常表现，血清中载脂蛋白（ApoA2）、甘油三酯（TG）升高，ApoB、人锌α2 糖蛋白（AZGP1）降低，血脂表现异常，证实ApoA2、ApoB、AZGP1、TG 为HIV/AIDS 肺脾气虚证的潜在生物学标志物。以上研究证实差异代谢物可反映病理所对应的代谢异常物质和功能的改变，并能确定其代谢通路的异常，表明代谢组学技术与传统中医学理论相结合有广阔的应用前景。

本研究显示，肺纤维化组（PCA 图）在治疗后向健康对照组融合回归，2 组代谢物质类似，表明参苓白术丸联合黄芪颗粒治疗肺纤维化肺脾气虚证有显著临床疗效。肺纤维化组治疗后磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4等成分较治疗前下降，趋向于对照组水平。说明参苓白术丸联合黄芪颗粒干预治疗后，患者的病情得到一定程度恢复，反映了其作为潜在证候标志代谢物的可靠性，进而推测出参苓白术丸联合黄芪颗粒治疗可通过下调磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4 等代谢物质而发挥治疗作用，其中对脂类代谢物质（磷脂酰胆碱、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4）改善显著，表明脂类代谢异常与肺纤维化的发生发展有密切联系，因此结合相关的脂类变化，找到异常的代谢通路，识别脂类生物标志物，对肺纤维化的病因及治疗提供指导以及提供新的药物治疗靶点，从而进一步提高临床疗效。肺纤维化组治疗后的代谢通路为神经酰胺酶代谢、磷脂酶代谢为代表的鞘磷脂类代谢为主，表明参苓白术丸联合黄芪颗粒通过神经酰胺酶、磷脂酶通路参与改善肺纤维化发病过程，神经酰胺酶、磷脂酶类代谢通路的差异性是肺纤维化炎症等症状存在的基础，进一步证实了以神经酰胺酶、磷脂酶为代表的鞘磷脂类代谢通路的差异性是参与肺纤维化疾病发展过程中的主要通路所在。大量研究[15]表明，脂类代谢异常与呼吸系统疾病的发生发展有着密切联系，鞘磷脂主要位于细胞膜和脂蛋白中，主要参与细胞信号转导、增殖、凋亡等过程。有证据[16-17]表明，鞘磷脂类信号通路在肺纤维化的发病中起着重要作用，鞘磷脂参与肺纤维化疾病主要是受到神经酰胺水平的调控，机体在氧化应激的情况下诱导鞘磷脂酶活化及产生神经酰胺从而导致疾病的发生，鞘磷脂酶抑制剂可能成为一类新的药物在防治肺纤维化中发挥重要作用。因此，基于中医方证对应疗效的专属性，利用中医证候代谢组学，识别脂类生物标志物，发现异常的代谢通路，建立方剂药效生物评价体系，能够深入揭示肺纤维化的发病机制和提供新的药物治疗靶点，进而指导临床用药。