桑叶槲皮素对D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力及肠道菌群的影响

黄思莹， 黄春萍， 刘 旭， 佘诗琪， 勾 洵

（四川师范大学 生命科学学院，四川 成都610101）

衰老是一种复杂的生理过程，是机体随着年龄的增加而出现的各生理器官和功能的退行性变化.随着现代医学和生物学的迅速发展，自由基学说成为最具有代表性的可能机制之一：随着年龄的增大，生物体中清除自由基的抗氧化酶活性下降，自由基逐渐堆积从而加速衰老［1］.因此，如何清除生物体内过量的自由基已经成为抗氧化研究的重难点问题，天然产物所具有的安全无副作用及特有的多种生物活性物质受到了越来越多的关注.作为“药食同源”的重要植物资源，桑叶（Morus alba L.）具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖和降低胆固醇等多种药理作用，含有多糖、氨基酸、黄酮、维生素等多种生物活性组分［2-4］.与多糖类似，黄酮类化合物是桑叶主要活性成分之一，具有多种药理作用和活性功能.文献［5］报道桑叶黄酮类化合物含量在所有植物茎叶中较高，占桑叶干物质量的3%左右.研究显示，桑叶黄酮类化合物能清除人体中超氧离子自由基，是一类天然抗氧化剂，但其作用机制仍不明确.此外，不同种类和不同结构的黄酮类化合物的抗氧化功效均不相同［5-6］.作为多羟基黄酮类化合物，槲皮素（quercetin）被现代医学研究证明具有抗肿瘤、降血糖和降血脂等作用［7-8］.桑叶槲皮素（MAQ）对衰老小鼠的抗氧化作用和其摄入后对小鼠肠道菌群的影响及机制未见报道.本研究以桑叶槲皮素为研究对象，研究其对D -半乳糖致衰老模型小鼠免疫功能、抗氧化能力以及肠道菌群多样性的影响，以期探索桑叶槲皮素在预防衰老方面的作用.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 桑叶，购自于当地农贸市场，经四川师范大学生命科学学院植物学教研室鉴定为桑叶.

总抗氧化能力（T -AOC）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、粪便基因组提取试剂盒（中国天根生化科技有限公司）、芦丁标准品（四川省维克奇生物科技有限公司），石油醚、乙醇、抗坏血酸、D -半乳糖、亚硝酸钠、硝酸铝和NaOH 等均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备 电子天平（万分之一，赛多利斯科学仪器北京有限公司），超声清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），台式低温冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），紫外可见分光光度计Spekoll 500（AJ 耶拿），旋转蒸发仪R -3（Buchi），电泳仪（Bio-RAD），凝胶成像系统（Bio-RAD）.

1.3 实验动物 ICR 小鼠60 只，雄性，18 ～22 g，购自四川省成都达硕实验动物有限公司（生产许可证：SCXK（川）2015 -030）.小鼠自由进食、饮水，室温保持25 ℃左右（动物实验许可证：SYXK（川）2013 -185）.

1.4 试验方法

1）桑叶中槲皮素的提取［9］.将桑叶粉与石油醚以1∶ 20 的比例，在50 ℃、200 W的条件下超声波处理20 min，过滤出残渣，将残渣重复提取一次；随后将残渣放置70 ℃烘箱烘干；按料液比1∶ 25的比例加入体积分数为50%的乙醇溶液，超声波提取3 次（温度70 ℃，功率200 W，时间30 min）；抽滤，合并滤液后利用旋转蒸发仪，真空减压浓缩，回收乙醇.利用芦丁标准液建立标准曲线的方法检测槲皮素含量.

2）动物分组与衰老模型建立. ICR 雄性小鼠60 只，适应性喂养3 d 后，随机分为空白对照组（CG）、衰老模型组（MG）、阳性对照组（PC）、MAQ高（MAQ - H）、MAQ 中（MAQ - M）和MAQ 低（MAQ-L）剂量组.空白对照组腹腔注射0.9%生理盐水；其余5 组腹腔注射D -半乳糖120 mg／（kg·d），持续8 周建立小鼠衰老模型.

3）槲皮素的灌胃治疗.建模完成后，桑叶槲皮素低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg／（kg·d）；阳 性 对 照 组 灌 胃 抗 坏 血 酸100 mg／（kg·d）；空白对照组与衰老模型组给予等量的生理盐水灌胃，给药持续30 d.

4）指标检测及方法.治疗结束后禁食1 d，眼球采血，根据试剂盒说明书检测GSH - Px 活性、T-AOC、SOD活性和MDA 含量.同时无菌条件下取小鼠胸腺、脾脏，称重并计算胸腺、脾脏指数如下：

5）小鼠肠道细菌总DNA提取.小鼠灌胃治疗期间，每10 d 测量小鼠体质量并收集小鼠新鲜粪便.称取0.2 g粪便样品，按照粪便基因组提取试剂盒使用说明操作.通过超微量核酸蛋白测定仪以OD260／OD280 评价DNA的纯度并测定DNA浓度，-20 ℃低温保存备用.

6）16S rDNA V3 可变区PCR扩增.利用带GC夹子的细菌通用引物对16S rDNA 的V3 区进行PCR扩增.引物序列为341F -GC：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC CTACGGGAGGCAGCAG-3'和534R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG - 3'. PCR 反应体系（25 μL）：ddH2O 8. 5 μL，2 × Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL，上下游引物均为1 μL，DNA 模板2 μL.PCR 反应条件：94 ℃，预变性5 min，94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共30 次 循 环；72 ℃，10 min；4 ℃保存.1.0%琼脂糖电泳检测PCR产物.

7）变性梯度凝胶电泳（DGGE）.本次实验使用美国Bio -Rad 公司Dcode DGGE 系统，将16S rDNA V3 区的PCR 扩增产物于8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离.变性剂质量分数范围为30% ～60%，变性梯度方向与电泳方向一致，电泳在恒温60 ℃下的1 ×TAE缓冲液中进行，90 V电泳8 h，电泳结束后使用AgNO3染色，凝胶成像系统检测并用Quantity One® v4.6.2（Bio -Rad，Hercules，CA）软件（简称Quantity软件）拍照记录结果.

8）肠道菌群的多样性分析.利用Quantity软件将PCR-DGGE图谱变换为条带图谱和波峰图谱，采集图中条带数目和灰度值，然后用Shannon -Weaver（H′）指数来分析各组小鼠肠道菌群的多样性，

公式中ni为个体第i条条带的峰面积，N为此个体所有条带的峰面积之和.

9）数据分析.所得数据经SPSS 20.0 软件处理，正态性检验后，服从正态分布的数据以¯x ±s表示，进行单因素方差分析.

2 结果与分析

2.1 桑叶槲皮素对小鼠胸腺、脾脏指数的影响 与空白对照组相比，衰老模型组的胸腺和脾脏指数均显著降低（P ＜0.05）.与衰老模型组相比，桑叶槲皮素低剂量和中剂量组的胸腺指数增加明显（P ＜0.05），高剂量组和阳性对照组极显著提高（P ＜0.01）；而桑叶槲皮素中、高剂量组的脾脏指数有所增加（P ＜0.05），低剂量组无明显差异（P ＞0.05），阳性对照组升高明显（P ＜0.01，见表1）.

表1 桑叶槲皮素对小鼠胸腺、脾脏指数的影响（n ＝10，±s）Tab. 1 Effects of MAQ on thymus and spleen indices in mice（n ＝10，±s）

表1 桑叶槲皮素对小鼠胸腺、脾脏指数的影响（n ＝10，±s）Tab. 1 Effects of MAQ on thymus and spleen indices in mice（n ＝10，±s）

注：与空白对照组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与衰老模型组相比*P ＜0.05，**P ＜0.01.

组别 胸腺指数 脾脏指数空白对照组（CG） 0.04 ±0.06 0.67 ±0.12衰老模型组（MG） 0.29 ±0.04 ## 0.46 ±0.09 #阳性对照组（PC） 0.39 ±0.05 ** 0.63±0.11**MAQ低剂量组（MAQ-L） 0.35 ±0.04 * 0.53 ±0.15 MAQ中剂量组（MAQ-M） 0.36 ±0.04 * 0.55 ±0.14 *MAQ高剂量组（MAQ-H） 0.36 ±0.06 ** 0.57 ±0.17*

2.2 桑叶槲皮素对小鼠血清中T -AOC、SOD 和MDA含量的影响 由表2 可知，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠在D -半乳糖的作用下，血清的T -AOC、SOD 和GSH -Px 活性显著降低（P ＜0.01），MDA含量升高（P ＜0.01）.在灌胃桑叶槲皮素后，与衰老模型组小鼠相比，桑叶槲皮素低剂量组GSH-Px活性有所提升（P ＜0.05），MDA 含量降低（P ＜0.05）；中、高剂量和阳性对照组小鼠血清的T-AOC、SOD和GSH-Px活性均有不同程度增加（P ＜0. 05），MDA 含量极显著降低（P ＜0.01）.

2.3 V3 区16S rDNA PCR 扩增结果 小鼠肠道菌群如图1 琼脂糖凝胶电泳所示，特异性扩增产物片段长度在200 bp左右，与预期相符.

表2 桑叶槲皮素对小鼠血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px的影响（n ＝10，±s）Tab. 2 Effects of MAQ on T-AOC，SOD，MDA and GSH-Px in serum of mice（n ＝10，±s）

表2 桑叶槲皮素对小鼠血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px的影响（n ＝10，±s）Tab. 2 Effects of MAQ on T-AOC，SOD，MDA and GSH-Px in serum of mice（n ＝10，±s）

注：与空白对照组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与衰老模型组相比*P ＜0.05，**P ＜0.01.

组别 T-AOC水平／（U／mL） SOD活性／（U／mL） MDA含量／（nmol／mL） GSH-Px活性／（U／mL）空白对照组（CG） 16.38 ±2.11 119.75 ±4.99 6.61 ±1.22 16.52 ±0.87衰老模型组（MG） 6.73 ±1.20 ## 103.79 ±.5.35 ## 13.89 ±1.76 ## 9.23 ±0.65 ##阳性对照组（PC） 14.93 ±2.53 ** 117.54 ±4.21 ** 7.24 ±1.12 ** 14.64 ±0.66 **MAQ低剂量组（MAQ-L） 8.27 ±0.88 105.52 ±6.15 11.54 ±0.68 * 11.80 ±0.74 *MAQ中剂量组（MAQ-M） 10.32 ±0.43 * 108.17 ±4.49 * 9.51 ±1.01 ** 13.12 ±0.69 **MAQ高剂量组（MAQ-H） 12.43 ±1.65 ** 115.23 ±5.38 ** 8.35 ±1.18 ** 14.27 ±0.61**

2.4 肠道菌群的多样性分析 灌胃治疗第0 d，即8 周衰老模型完成时，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠肠道菌群多样性显著降低（P ＜0.01），表明衰老可能会导致小鼠肠道菌群多样性下降.与衰老模型组相比，阳性对照及治疗组没有差异（P ＞0.05）.灌胃治疗第10 d，衰老模型组小鼠肠道菌群多样性低于空白对照组和阳性对照组（P ＜0.05）.灌胃治疗第30 d，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠肠道菌群多样性较低，但差异不显著（P ＞0.05）；与衰老模型组相比，阳性对照组和桑叶槲皮素低剂量组小鼠肠道菌群多样性有所增加，但差异不显著（P ＞0.05），桑叶槲皮素中剂量组小鼠肠道菌群多样性增加明显（P ＜0.05），高剂量组小鼠肠道菌群多样性有极显著增加（P ＜0.01）.见图2 ～3.

3 讨论

根据衰老的代谢紊乱学说，在一定时间内连续注射D-半乳糖可导致细胞代谢紊乱，自由基氧化与抗氧化作用动态平衡失调，使个体细胞易受自由基的伤害，导致机体加速衰老［10］.本实验中的衰老模型组小鼠在注射过D -半乳糖后，T -AOC 水平、GSH-Px和SOD活性显著降低，MDA含量升高，证明D-半乳糖建立衰老模型成功.

图1 小鼠肠道菌群16S rDNA的V3区PCR产物Fig. 1 16S rDNA PCR products of gut microbiota from different groups of mice

图2 桑叶槲皮素对衰老小鼠肠道菌群多样性指数的影响（n ＝5，±s）Fig. 2 Effects of MAQ on indices of gut microbiota diversity in aged mice（n ＝5，±s）

图3 灌胃第30 d桑叶槲皮素对衰老小鼠肠道菌群多样性的影响（n ＝5，±s）Fig. 3 Effects of MAQ on gut microbiota diversity of aged mice in 30 d（n ＝5，±s）

机体抗氧化能力的强弱与健康程度存在密切的关系，作为机体重要的免疫器官，胸腺和脾脏指数反应机体内淋巴细胞增殖程度，与免疫调节功能密切相关.T-AOC是对机体抗氧化能力的总体评价，抗氧化酶类能够清除和分解体内过量的和H2O2等自由基，其中SOD就是重要的抗氧化酶之一，维持机体抗氧化动态平衡.GSH -Px 能通过阻断氧化还原反应防止过氧化物对机体的损害.MDA是细胞膜脂质过氧化物，可反映出机体内脂质的过氧化程度，MDA含量的高低间接反映了机体受到自由基攻击的严重程度［11-12］.

本研究与衰老模型组相比，桑叶槲皮素高剂量组T-AOC 水平、GSH -Px 和SOD 活性显著升高，MDA含量显著降低，与阳性对照组效果相似；中、低剂量组也能不同程度提高机体抗氧化能力.说明桑叶槲皮素具有清除体内自由基、增强机体抗氧化能力的作用.

现有研究表明，人和动物体内肠道菌群的状态和宿主的健康密切相关.正常菌群可刺激机体免疫系统，拮抗许多致病菌的生长，清除体内有毒物质［13］.病理状态下的肠道微生态受到破坏，而外源性的调节剂如益生菌能够改善微生态环境，起到良好的预防和治疗作用［14-15］.

本研究中，小鼠在接受D -半乳糖持续给药建立衰老模型后，肠道菌群多样性降低，表明体内肠道微生态紊乱.在桑叶槲皮素灌胃治疗后，小鼠肠道菌群多样性逐渐升高，证明桑叶槲皮素可能通过调节肠道菌群，增加菌群多样性，从而改善机体的部分生理功能，起到延缓衰老的作用.

4 结论

本实验研究表明，槲皮素可显著提高衰老小鼠机体的总抗氧化能力T-AOC 水平，降低衰老小鼠脂质过氧化物MDA 含量，有效清除体内产生的过量自由基，具有明显的抗氧化作用.同时肠道菌群多样性研究表明，桑叶槲皮素灌胃后能明显改善小鼠肠道菌群多样性，改善机体生理功能，但抗氧化机制、肠道菌群多样性的具体变化与桑叶槲皮素的构效关系仍然需要进一步的研究.

致谢 四川师范大学实验技术与管理项目（SYJS2017028）对本文给予了资助，谨致谢意.