阴阳室微生物燃料电池对磺胺嘧啶的降解性能及其产物生物毒性

汪素芳, 郑杰蓉, 赵晓婵, 李培瑞, 董 静, 岳秀萍

(太原理工大学环境科学与工程学院，太原 030024)

磺胺类药物作为一类人工合成的抗生素，广泛用于人类医疗和养殖行业。目前在天然水体、家庭废水、药厂废水及污水处理厂出水中均可检测出低浓度的磺胺类药物[1-2]。已有研究表明，低浓度磺胺类药物进入水体环境后，可诱导耐药菌株的产生且不易被生物降解，使得该类药物在水体和其他环境介质中富集，对生态环境和人类健康构成巨大威胁[3-4]。磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)作为磺胺类药物的代表，极易在环境中富集，使耐药菌株的存活率增大，即微生物抗药性增强，对人和其他生物疾病的治疗造成不利影响[5-7]。因此，SDZ去除技术以及去除规律值得深入研究。

目前，处理SDZ的方法主要有物理法，化学法和生物处理法。吴南村等[8]采用Fenton法对污水中SDZ进行高级氧化处理，结果表明Fenton法对受磺胺类药物污染的水体具有良好的修复作用，去除率可达到99.8%。但该方法有一定的弊端，当废水中有机物浓度较高时，H2O2和Fe2+投加量大，操作过程烦琐，一系列副产物需后续处理才可得到去除。Ziemiańska等[9]使用TiO2-P25/FeCl3紫外光催化氧化污水中残余的磺胺类药物，达到相当明显的去除效果，但此法的催化剂难以回收，活性成分损失较大以及后续操作比较复杂，难以进行大规模的工程运用。与物理、化学方法相比，生物处理法具有设备简单、操作方便、投资少、运行费用低、二次污染小等优点。但是，由于磺胺类抗生素对生物过程有强烈抑制作用，常规生物处理方法很难达到理想的去除效果。因此，需要寻找一种新的方法将污水处理与能量回收联系起来，从而抵消运营成本。

微生物燃料电池(microbial fuel cell, MFC)是在传统燃料电池基础上将其与微生物相结合，通过电极反应的进行实现废水的有效处理，同时达到电能回收、降低能耗的目的[10]。Shen等[11]发现使用MFC去除污水中对硝基苯酚的效果明显优于同等反应条件下的厌氧反应器。该技术对去除污水中难降解有机污染物在操作性和功能性方面具有一定优势[12]。

本实验选用阴阳室MFC反应器，首次以石墨毡作为电极材料，SDZ为单一底物驯化功能微生物菌群，检测微生物驯化过程中底物SDZ的浓度变化及其矿化程度，探讨MFC反应体系中微生物对SDZ的降解规律，通过UPLC-MS/MS测定微生物降解SDZ过程中的主要中间产物并推测其代谢路径。同时采用数据采集系统记录微生物驯化初期体系中电压的变化趋势，通过功率密度考察MFC的产电性能。最后以大肠杆菌作为受试菌体，在周期末对SDZ降解产物进行毒性检测，从而验证此工艺在SDZ污水处理工程中的可适用性和有效性。

1 材料与方法

1.1 实验装置

本实验采用MFC对污水中SDZ进行降解，反应器为阴阳室反应器，包括阳极室、阴极室、质子交换膜和外电路等。该反应器选择导电性能好，孔隙率高的石墨毡为电极材料，由石墨棒通过外电路将阳极与阴极连接起来形成闭合回路。构型示意图如图1所示。

图1 MFC反应器构型图

反应器由有机玻璃制成，阳极室与阴极室的有效体积均为250 mL。阳极室内放置SDZ反应液和活性污泥，阴极室内为50 mmol/L的铁氰化钾溶液。电极材料为直径3 cm、高度10 cm的柱状石墨毡，连接外电路的导电材料为直径4 mm、长20 cm的石墨棒，外电阻为1 000 Ω。外电路用导线与阳极和阴极的石墨棒连接，使整个电路形成闭合回路。MFC在微生物降解SDZ的同时输出电压，由数据采集系统(Keithley 2700)收集并在计算机进行记录，每隔10 min自动记录一次数据。

1.2 MFC中活性污泥的驯化

本实验活性污泥取自晋中市正阳污水处理厂的污泥浓缩池，该水厂采用SBR污水处理工艺。阳极室内活性污泥与反应液的体积比为1∶5，其中反应液为人工模拟SDZ废水，由一定浓度的SDZ和营养液组成。营养液配比为KCl(0.13 g/L)、NH4Cl(0.31 g/L)、Na2HPO4·12H2O(11.55 g/L)、NaH2PO4·2H2O(2.77 g/L)、Wolfe维生素微量元素液(10 mL/L)、Wolfe矿质元素液(10 mL/L)，调节 pH为7.0。本实验以开路MFC反应器(厌氧反应器)为对照，两组各设三个平行实验，所测实验结果在可接受的误差范围(1%)内取平均值。微生物驯化周期为15 d。反应器启动后，前两个月阳极室内SDZ浓度为10 mg/L。为了富集更多与SDZ降解相关的微生物菌群，每周期更换反应液时将反应器中的一半污泥取出，加入等量新鲜污泥。从微生物驯化第三个月开始，每两个周期将反应体系中SDZ的浓度提高一个水平，SDZ浓度分别为20、30、40 mg/L。每次更换反应液后，在阳极室注入氮气创造厌氧环境。在每个周期定期采样，测定SDZ浓度及总有机碳(TOC)。SDZ浓度为40 mg/L时，用UPLC-MS/MS检测中间产物，并在周期末对SDZ代谢产物进行生物毒性检测。

1.3 分析方法

1.3.1 SDZ浓度及TOC测定

首先对实验所用SDZ(Sigma-Aldrish,99.8%)药品进行检测，使用液相色谱仪(Agilent Technologies 1260 Infinity II, RSD <1%)测得本SDZ药品的加样回收率为99.1%，因此以下所测结果具有一定的可信度。其次，用孔径为0.22 μm的有机滤膜对样品进行过滤后，用高效液相色谱仪测定样品中SDZ浓度，流动相为乙腈和甲酸水(5‰)，体积比为2∶8，流速为1 mL/min，SDZ检测波长为270 nm。用0.45 μm的无机膜过滤样品，由TOC分析仪(TOC-V CPH，岛津公司，RSD <1%)测定总有机碳(TOC)和无机碳(IC)。

1.3.2 中间产物的测定

以甲酸水(5‰)(A)为水相，乙腈(B)为有机相，采用UPLC-MS/MS对SDZ代谢产物的样品进行分析。流动相比例梯度为: 0～4 min: A%∶B%=80∶20; 5～7 min: A%∶B%=60∶40; 8～9 min: A%:B%=80∶20。PDA检测采用200～360 nm波长的连续扫描。MS/MS分析使用电喷雾电离(ESI+和ESI-)在50～500 m/z的质量扫描范围内进行。

1.3.3 产物生物毒性检测

为验证MFC反应体系降解SDZ后，其出水是否对人体健康造成安全隐患，本实验以大肠杆菌为受试菌体，在周期末对SDZ降解产物进行了毒性检测，步骤如下：①样品的准备：从反应器中取出周期末反应液，在高速离心机中离心(8 000 r/min，20 min)后，用直径为0.22 μm的有机滤膜过滤；②大肠杆菌的培养：从-80 ℃冰箱拿出纯大肠杆菌，在0 ℃以下的环境中放置30 min，接种到经过高压灭菌后的LB培养基中进行扩培，直到大肠杆菌进入对数增殖期进入下一步试验；③在分别装有8 mL反应器出水样品(实验组)、超纯水(空白组)、10 mg/L SDZ溶液(对照组)的离心管中各接种0.5 mL扩培的大肠杆菌菌液，然后加入1.5 mL高浓度LB培养基使得离心管中LB培养基为正常浓度，最后在恒温培养箱(37 ℃)放置24 h后测定OD600值。

1.3.4 MFC产电性能

为考察以石墨毡为电极材料时MFC的产电性能，在反应体系中加入200 mg/L乙酸钠和30 mg/L SDZ(使得配水中COD更接近实际药厂废水)，测定MFC反应体系的功率曲线和极化曲线。在反应周期中电压值最大时，改变MFC外电路的电阻值(Rext)，得到不同电阻条件下的电压及电流(由I=E/Rext可得)，其中Rext分别为10、50、100、200、500、700、1 000、2 000、3 000、5 000、7 000、10 000 Ω。电流密度由电流除以石墨毡横截面积可得。根据P=E2/R和P=I2R(其中I为电流)可得各个电流密下的功率密度。

2 结果与讨论

2.1 微生物驯化初期MFC的电压变化

MFC反应器启动后，微生物驯化初期的电压数据如图2所示。由每个周期的电压变化趋势可得，在反应初期，MFC系统中的电压快速升高，20 h左右即可达到最大值。之后体系中的电压在总体上呈缓慢下降的趋势，并伴随微小的起伏波动，为MFC在降解SDZ的过程中出现的氧化还原峰，最终系统中电压稳定在0.2 V左右。

图2 微生物驯化期MFC电压

从四个周期电压变化的整体趋势来看，随着微生物培养时间的延长，每个周期的最大电压逐渐变小，驯化初期体系中的最大电压约为0.8 V，到第四个周期减少到0.45 V。这是由于体系中的SDZ对部分微生物的生长具有一定的抑制作用，使得反应体系中微生物活性降低。在微生物驯化过程中，体系中能够降解SDZ的微生物菌群不断繁殖累积，而不能适应SDZ环境的微生物在逐渐衰亡淘汰，从而达到SDZ降解功能菌群驯化的目的。

2.2 MFC的产电性能

改变MFC两端电阻，得到不同Rext下的电压值。如图3所示，Rext<1 000 Ω时，随着Rext的增大，MFC两端的电压快速增大，Rext=1 000 Ω时，电压值为0.604 V；Rext>1 000 Ω时，随着Rext的增大，MFC两端的电压缓慢增加并趋于平稳。当Rext增加到10 000 Ω时，MFC两端电压为0.676 V。

图3 MFC中不同外阻条件下的电压值

此外，本实验通过测定极化曲线，表征在一定电流条件下MFC可得到的最大电压。由于MFC受特定微生物菌群的限制，随着Rext的增大，在系统中有一个最大电压OCV。如图4所示，电流密度接近零(Rext为无穷大)时，MFC两端的电压最大，OCV为0.698 V。从功率曲线可以看出，随着电流密度的增大，功率密度先增大后减小，呈“单峰型”，当电流密度为0.139 mA/cm2时，系统中功率密度是678 mW/m2，为最大功率密度。该实验中MFC功率密度高于其他碳电极材料(如碳刷、碳布等)的MFC[13]。由此可见，以石墨毡为电极材料时，MFC具有良好的产电性能。

图4 极化曲线和功率曲线

图5 MFC反应器对SDZ的去除效果

2.3 MFC对不同浓度SDZ的降解规律

MFC启动完成后，测定各个周期SDZ的浓度变化。MFC反应体系中微生物对不同浓度SDZ的降解规律如图5所示。在微生物驯化第三个月时，反应器中SDZ初始浓度为20 mg/L。反应7 d后，厌氧反应器中SDZ浓度为6.58 mg/L，去除率为67.09%；MFC反应器中SDZ浓度为4.01 mg/L，去除率为79.97%。由此可见，SDZ初始浓度为20 mg/L时，MFC反应器在一定程度上促进反应体系中SDZ的降解。在微生物驯化第四个月时，反应器中SDZ初始浓度为30 mg/L，反应7 d后，厌氧反应器和MFC反应器中SDZ浓度分别为0.65 mg/L和1.18 mg/L，去除率分别为97.83%和96.07%，两种反应器对SDZ的降解效果没有显著差异。在微生物驯化第五个月时，反应器中SDZ的初始浓度提高到40 mg/L，反应7 d后，厌氧反应器中SDZ去除率为84.19%；MFC反应器中SDZ的去除率为98.23%，比厌氧反应器对SDZ的降解率超出14.04%。因此，在不同浓度水平下，与厌氧反应器相比，MFC反应器对SDZ的降解具有一定的优势。

从同一组反应器不同SDZ初始浓度的降解趋势来看，SDZ初始浓度为20 mg/L时，反应初期体系中SDZ浓度急剧减少。对于MFC反应器，反应2 d后体系中微生物对SDZ去除率可达49.37%，之后微生物对SDZ的降解速度减缓，5 d内仅降解30.60%；对于厌氧反应器，反应开始1 d后，体系中微生物对SDZ降解率可达53.73%，之后6 d内微生物对SDZ仅降解13.36%。这种降解趋势很大程度上与反应器中微生物所依附的体系有关。该反应体系中大量微生物附着在活性污泥和石墨毡表面，而活性污泥和石墨毡对有机物也有一定的吸附性。因此，在厌氧和MFC反应体系中，在反应初期大量SDZ吸附于活性污泥和石墨毡的表面，表现出SDZ浓度迅速降低。但这并不是真正的去除，而是体系中生物吸附和物理吸附共同作用的结果。经过一段时间后，这些被吸附于活性污泥和石墨毡表面的SDZ会有一部分脱附，体系中SDZ的浓度有所回升，如图5所示。在上述初期吸附完成后，吸附在活性污泥表面的SDZ会逐渐与生物细胞接触，进入细胞体内被微生物降解，使得SDZ得到真正的去除。当SDZ初始浓度为40 mg/L时，整个反应周期内反应体系中微生物对SDZ的降解速率基本不变，可能是由于微生物对SDZ的吸附和降解达到平衡。可见随着功能菌群的驯化，反应体系中微生物对SDZ的降解趋于稳定，表明反应器中的功能菌群驯化成熟。

本实验还测定了不同SDZ浓度条件下TOC的降解率来评价反应体系中SDZ的矿化程度，如图6所示。随着SDZ浓度的增大，厌氧和MFC反应体系中的微生物对TOC的去除效果越好，说明随着微生物的驯化，反应体系对SDZ的矿化程度越大。同时，MFC反应器对TOC的去除率整体上明显高于厌氧反应器。SDZ的初始浓度为40 mg/L时MFC体系中TOC的去除率可达65.13%，而厌氧反应器仅有51.14%，MFC反应器体现出更好的矿化性能。

总而言之，反应体系中SDZ的初始浓度在各个水平时，反应开始7 d后MFC对SDZ和TOC的去除效率均高于厌氧反应器，由此可见以石墨毡为电极材料的MFC反应器对SDZ和TOC的去除有良好的效果。

图6 TOC的去除率

2.4 MFC降解路径推测

实验根据所测得的主要中间产物，推测了两种SDZ降解路径，如图7所示。本实验中，SDZ在微生物反应体系中的降解主要包括SDZ水解，硫还原，C—N键断裂等反应。SDZ是由嘧啶部分和磺胺部分构成，连接磺胺部分和嘧啶部分的N—H键被水解后生成对氨基苯磺酸(P3)。之后体系中微生物代谢SDZ的一条主要路径是磺胺部分硫的还原，第一步硫还原生成对氨基苯亚磺酸(P4)，再脱氨基生成苯亚磺酸(P5)，最终P7脱落，形成苯环(P6)开环后被微生物降解。

图7 SDZ降解路径

由于反应体系中存在硫酸根离子，研究表明硫酸根离子作用于嘧啶环的C—N键，可形成P2,同时N—S键断裂，生成对氨基苯亚磺酸[14]，该降解路径在本实验中也得到了证实。

图8 空白组、对照组、实验组OD600值对比

2.5 出水生物毒性检测

本实验对普通的LB培养基(空白组)，含有10 mg/L SDZ的LB培养基(对照组)，以及用初始SDZ为40 mg/L的MFC周期末反应液配制的LB培养基(实验组)进行了实验，每组均设置三个平行实验,所测结果在可接受的误差范围内(1%)取平均值。如图8所示，实验结果表明，含有SDZ的LB培养基(对照组)在培养大肠杆菌24 h后，OD600值明显低于空白组和实验组，而含有周期末反应液的LB培养基(实验组)与普通LB培养基(空白组)的OD600值基本一致。由此可见，LB培养基中的SDZ对大肠杆菌的生长具有一定的抑制作用，而MFC周期末反应产物对大肠杆菌的生长并无抑制作用。因此使用以石墨毡为电极材料的MFC降解污水中的SDZ无生物毒性，属于绿色环保的污水处理工艺，可用于实际污水处理过程。

3 结论

首次以石墨毡为电极材料，采用阴阳室微生物燃料电池处理污水中的SDZ，主要性能表现如下。

(1)最优初始条件：当微生物驯化第五个月时，反应器中 SDZ初始浓度为40 mg/L，MFC反应器对SDZ的去除效果最好，此时微生物已驯化成熟。

(2)实验结果和应用优势：SDZ初始浓度为40 mg/L时，MFC对SDZ的去除在7 d内可达98.23%，且优于厌氧反应器，体现出良好的降解性能; MFC反应器对SDZ的矿化率在第7 d可达到65.13%，明显高于厌氧反应器，体现出良好的矿化性能; 以石墨毡为电极材料的MFC体系中最大功率密度为678 mW/m2，最大电压OCV为0.698 V，具有良好的产电性能; 产物生物毒性检测结果表明 MFC反应器出水无生物毒性，因而该技术为一项绿色、环保的技术。

(3)反应过程与机制：MFC反应体系中的微生物降解SDZ主要有两条路径，包括SDZ水解，磺胺部分硫的还原，嘧啶部分C—N键的断裂等化学反应，表明反应体系中具有不同功能的微生物菌群共同作用，通过MFC加快电子转移效率，从而促进污水中SDZ的生物降解。

4 展望

使用MFC降解废水中的SDZ，是一种高效环保的微生物技术。从本研究的角度来看，对传统MFC降解SDZ的代谢机理和功能微生物菌群的丰度和地位进行深入研究，可为污水处理厂的实际应用提供一定的理论基础。从宏观的角度来看，将MFC对SDZ的降解引申为对多种抗生素的降解，同时通过对MFC反应器结构和电极材料进行改造，在提高底物降解效率的同时，进一步提高反应器的产电性能，从而实现污水处理的资源化，并将其应用于实际药厂废水的治理，同样具有非常广阔的发展前景。