不同温度条件下高原多年生牧草幼苗的生理和生长对碱胁迫的响应

赵明德， 刘 晶 ，吉 云 ，阴梦琪， 李惠梅

(青海民族大学生态环境与资源学院,青海 西宁 810007)

【研究意义】土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广泛存在。改造治理与合理开发利用盐碱地资源，是中国农牧业发展的有效途径之一，同时也是抑制土壤盐碱化进一步加深的有效措施之一。对改善生态环境，保证一定区域内的经济、社会和生态可持续发展具有特别重要的意义[1]。盐碱土是一种重要的土壤类型，现如今它广泛分布于世界100多个国家, 全世界约有9.55×1012m2不同程度盐碱化的土地, 而这大面积的盐碱化土地中又有约37 %是苏打型盐碱土，既其特点是Na2CO3含量较高，pH值在8以上，对植物的离子毒害作用强[2]。大量的盐分跟碱分存在于土壤之中，这些盐分跟碱分的存在使得土壤的理化性质发生变化，进而导致大部分农作物赖以生存的环境遭到破坏甚至退化[3]。【前人研究进展】我国盐渍土主要分布为东部滨海盐渍土、东北松嫩平原盐渍土、西北内陆区盐渍土[4-5]。青海也存在大面积的盐渍土。主要分布于柴达木盆地等地区，土壤中盐分跟碱分含量高，土壤成分组成复杂，其中大部分为氯化物或硫酸盐[6]。碱胁迫包含离子毒害、渗透胁迫和根部外部高pH值(pH>8.5)等多重胁迫,是一种主要的非生物胁迫,在一定程度上严重危害着植物的生长发育和粮食作物的产量和品质[7]。研究证明:碱胁迫对牧草的影响极为明显。在高浓度下种子萌发时间推迟，发芽率降低胚芽和胚根生长缓慢；低浓度下对种子萌发的影响很小[8-9]。所以,了解碱胁迫以及掌握植物对碱胁迫做出应答机制，对改善生态环境,培育耐碱性作物品种、改良盐碱地具有重要的现实意义。碱胁迫是我国北方大部分地区植物和粮食作物的主要胁迫方式。相比较而言，碱胁迫比盐胁迫对植物造成的伤害更严重也更加复杂，需要更进一步地研究[10]。研究抗碱性较强的优质牧草是解决未来青藏高原牧草短缺问题的关键试验。老芒麦等禾本科牧草具有抗寒、耐旱、产量高等特点，而且对土壤的要求不高，根系入土深，是青海高寒牧草的当家品种[11]。【本研究切入点】本实验旨在揭示牧草抗碱机制，挑选出适宜在碱性土壤种植的耐碱性强且产量高的优质牧草。【拟解决的关键问题】该研究结果为碱土地的恢复与治理提供理论上的支持[12]，对治理风沙侵蚀、防止草场退化等提供科学依据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本实验所用的青牧一号老芒麦(Elymussibiricus)、同德老芒麦(Elymussibiricus)、青海草地早熟禾(Poapratensis)和洽草[Koeleriacristata(Linn.)pers]种子都由青海省畜牧兽医科学院提供，均为成熟饱满的种子。

1.2 试验方法

本试验在低温(6～15 ℃)和室温(15～25 ℃)2种处理下，以不同浓度的Na2CO3溶液处理过的1/2霍格兰德(Hoagland)营养液胁迫青牧一号老芒麦、同德老芒麦、青海草地早熟禾、洽草等4种高寒牧草的幼苗，通过测定茎长、可溶性糖含量、SOD酶活性、丙二醛含量以及胁迫处理后幼苗根部坏死情况，观测其一系列的生理生化指标的变化，总结出4种牧草的耐碱性规律。初步说明这4种牧草对碱胁迫的反馈机制, 通过对比不同碱浓度及温度处理下4种牧草的生理指标及其响应，找到适合高原气候条件下宜生长的牧草，为改善高原生态系统做出理论指导和科学的参考依据。

首先用蒸馏水浸泡选取的种子24 h后，去除不饱满的种子，之后用70 %的乙醇溶液对种子进行表面消毒30 s, 然后置于1%的次氯酸钠溶液中对种子表面消毒8 min。再用蒸馏水将种子清洗干净，直至没有明显的刺鼻味之后把种子均匀地播种在双层滴漏塑料盆中，塑料盆提前做消毒处理。

开始先用蒸馏水培养，当种子萌发长出幼苗时，将盆中的蒸馏水换成1/2霍格兰德营养液，做种子的适应性培养。48 h后，将幼苗分别转移到Na2CO3浓度为0(CK)、50、100、200、300 mmol·L-1的1/2霍格兰德(Hoagland)营养液中继续培养。实验分两组，光照强度均为3000～5000 lx，一组放置在室温的实验室，另一组放置在低温光照培养箱中[13]。实验共计40个处理(4种牧草和5个胁迫及2个温度处理)，每个处理3个重复。

1.3 测定方法

碱胁迫条件下牧草茎长的测定: 分别在幼苗植株不同浓度碱胁迫0、24、48、72、96 h后随机从盆中取出样品并用吸水纸将样品上的水吸干，将幼苗从根茎结合的地方剪开，分离得到茎，测定茎长，每个处理做3次重复[14]。

可溶性糖含量的测定方法采用蒽酮比色法[11]，SOD活性的测定方法采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法[15]，丙二醛含量的测定方法采用硫代巴比妥酸法并参照高俊凤[16]和喻晓丽[17]的方法。

植株幼苗的根尖细胞死亡情况用台盼蓝染色法: 用配制的台盼蓝溶液去处理准备好的幼苗的根，如果幼苗的根部细胞有损伤或者死亡的情况时，台盼蓝就可以透过已经变性的细胞膜与膜里面解体的DNA分子结合并使其着色，所以可以用这个方法辨别细胞的死亡情况或者观测根尖细胞损伤情况。具体做法是将冲洗干净的幼苗根尖浸入台盼蓝溶液5 min后吸去染液，用蒸馏水清洗多次，直至滴下的蒸馏水无明显蓝色。再用蒸馏水浸泡1 h，取出根尖，制成玻片，每个玻片放5～10个样品，观察幼苗根尖染色情况。幼苗根尖细胞死亡或者损伤数目越多，蓝色越明显，反之颜色越浅[16]。

1.4 数据处理与分析

利用SPSS11.0进行数据的方差分析(ANOVA)和数据之间的显著性检验，再利用Origin2018绘图软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同温度和碱胁迫对青海草地早熟禾、青牧一号老芒麦、同德老芒麦、洽草的可溶性糖含量的影响

从图1-a可以看出，青海草地早熟禾的可溶性糖含量在低温条件处理下，呈现出先增加后降低的趋势并且差异显著。其中在碱胁迫浓度为100 mmol·L-1时出现峰值。在室温条件处理下，出现先降低后增加的趋势，分别在CK和200 mmol·L-1时出现最大值。低温和室温处理下，可溶性糖的含量差异显著。

从图1-b可以看出，青牧一号老芒麦的可溶性糖含量在低温处理时出现先增高后降低的趋势，在碱胁迫浓度100 mmol·L-1时达到峰值。同样在室温处理下也出现先增高后降低的趋势，糖含量增加显著。在碱胁迫浓度200 mmol·L-1时出现峰值。在碱胁迫浓度为50 mmol·L-1时，低温和室温处理下的可溶性糖含量差异不显著。在碱胁迫浓度为100、200、300 mmol·L-1时，室温处理下的可溶性糖含量显著高于低温处理下的可溶性糖含量。

从图1-c可以看出，同德老芒麦的可溶性糖含量在低温处理下，随着碱胁迫浓度的增加逐渐升高且差异显著。在碱浓度为300 mmol·L-1时出现峰值。在室温处理下，可溶性糖含量随着碱胁迫浓度的增加出现先增加后降低的趋势，在碱胁迫浓度为100 mmol·L-1时出现最大值。在不同温度处理下，碱胁迫浓度除200 mmol·L-1外，其余0、50、100、300 mmol·L-1时可溶性糖含量差异显著。在碱胁迫浓度较低(50、100 mmol·L-1)时，室温处理下的牧草可溶性糖含量显著高于低温处理下的可溶性糖含量。

从图1-d可以看出，洽草的可溶性糖含量在低温处理下随着碱胁迫浓度的增加逐渐降低，在碱胁迫浓度为300 mmol·L-1时可溶性糖含量最高。在碱胁迫浓度为100 和200 mmol·L-1时可溶性糖含量差异显著。在室温条件处理下，随着碱胁迫浓度的升高可溶性糖的含量逐渐增加且差异显著，在300 mmol·L-1时达到最大值。在碱浓度较低(50、100 mmol·L-1)时，低温处理下的可溶性糖含量显著高于室温处理下的可溶性糖含量。

图中不同小写字母表示低温下不同碱处理之间差异显著，不同的大写字母代表室温下不同碱处理之间差异显著，*代表相同碱浓度下高低温之间的差异显著，P<0.05，下同

图2 不同温度与碱浓度处理96 h后青海草地早熟禾(a)、青牧一号老芒麦(b)、同德老芒麦(c)与洽草(d)丙二醛含量

2.2 不同温度和碱胁迫对青海草地早熟禾、青牧一号老芒麦、同德老芒麦、洽草的丙二醛含量的影响

从图2-a可以看出，青海草地早熟禾的丙二醛含量在低温处理下，随着碱胁迫浓度的升高，出现先增高后降低的趋势。并且碱胁迫浓度0 (CK)与50 mmol·L-1、50 与100 mmol· L-1之间差异显著，在碱胁迫浓度较高时丙二醛含量差异不显著。在室温处理时，不同碱浓度处理下的丙二醛含量都与对照组丙二醛含量之间存在显著差异，但都呈现出降低的趋势。50、300 mmol·L-1碱胁迫浓度处理下，低温处理下的丙二醛含量显著高于室温处理下的丙二醛含量。

从图2-b可以看出，青牧一号老芒麦的丙二醛含量在低温处理下，随着碱胁迫浓度的升高，逐渐降低，且差异显著。在室温处理下，随着碱胁迫浓度的升高，呈现出先增加后降低的趋势，峰值出现在50 mmol·L-1时。在同浓度碱胁迫处理下，室温处理下的丙二醛含量显著高于低温处理下的丙二醛含量。

从图2-c可以看出，同德老芒麦的丙二醛含量在室温处理和低温处置时，都随着碱胁迫浓度的升高出现先降低后增加的趋势，且差异显著。对照组室温处理下的丙二醛含量显著高于低温处理下的丙二醛含量。

从图2-d可以看出，洽草的丙二醛含量在低温处理下，随着碱胁迫浓度的升高逐渐增加，在碱胁迫浓度为300 mmol·L-1时最大。在室温处理下，随着碱胁迫浓度的升高逐渐降低，在碱胁迫浓度为200 mmol·L-1时最低。在碱胁迫浓度较高(100、20、300 mmol·L-1)时，室温处理与低温处理的丙二醛含量之间差异显著，且低温处理下的显著高于室温处理下的丙二醛含量。

2.3 不同温度和碱胁迫对青海草地早熟禾、青牧一号老芒麦、同德老芒麦、洽草的SOD酶活的影响

从图3-a可以看出，青海草地早熟禾的酶活在低温处理与室温处理的情况下，都随着碱胁迫浓度的升高呈现出先增加后降低的趋势，并且都在碱胁迫浓度为100 mmol·L-1时出现最大值。在相同浓度碱胁迫处理下，100 mmol·L-1时室温处理下的早熟禾酶活显著低于低温处理下的早熟禾酶活。

从图3-b可以看出，青牧一号老芒麦的酶活在低温与室温两个处理下，都随着碱胁迫浓度的升高出现先升高后降低的趋势且差异显著。低温处理时，在碱胁迫浓度为100 mmol·L-1时出现最大值。室温处理时，在碱胁迫浓度为50 mmol·L-1时出现最大值。在碱胁迫浓度较高时，不同温度处理下的老芒麦酶活之间差异显著，并且在碱胁迫浓度为100、200、300 mmol·L-1时，低温处理下的酶活显著高于室温处理下的酶活。

图3 不同温度与碱浓度处理96 h后青海草地早熟禾(a)、青牧一号老芒麦(b)、同德老芒麦(c)与洽草(d)SOD酶活性的变化

图4 不同温度与浓度处理96 h后青海草地早熟禾(a)、青牧一号老芒麦(b)、同德老芒麦(c)与洽草(d)茎长的变化

从图3-c可以看出，在相同浓度碱胁迫处理下，0 (CK)、300 mmol·L-1时，低温处理下同德老芒麦酶活显著高于室温处理下酶活。50 mmol·L-1时，差异不显著。低温处理时，在200 mmol·L-1时出现最大值。而室温处理在300 mmol·L-1时，出现最小值。低温处理时，其他处理组都与对照组酶活之间差异显著。

从图3-d可以看出，洽草酶活低温处理时，在碱胁迫浓度为50 mmol·L-1时，出现最大值，且与对照组之间差异显著。在室温处理时，在300 mmol·L-1时出现最小值，与对照组之间差异显著。在碱胁迫浓度为50、100、300 mmol·L-1时，低温处理下的洽草酶活显著高于室温处理下的洽草酶活。

2.4 不同温度和碱胁迫对青海草地早熟禾、青牧一号老芒麦、同德老芒麦、洽草的茎长的影响

本实验做了不同温度0～15、15～25 ℃与不同浓度碱胁迫0 (CK)、50、100、200、300 mmol·L-1处理下的牧草幼苗茎长的测量，每隔24 h测量1次，图4为96 h时的茎长。

从图4-a可以看出，青海草地早熟禾的茎长在2个温度处理下都随着碱胁迫浓度的升高逐渐降低，且都分别与对照组存在显著差异。在同浓度碱胁迫处理下，对照组和碱胁迫浓度为50、200 mmol·L-1时，2个温度处理之间茎长存在显著差异。0 (CK)和200 mmol·L-1时，低温处理下的茎长显著高于室温处理下的茎长。

从图4-b可以看出，2个温度处理下，青牧一号老芒麦的茎长都随着碱胁迫浓度的升高而降低。对照组中，低温处理下的茎长显著高于室温处理下的茎长。在碱胁迫浓度较高(50 、100、200 mmol·L-1)时，低温处理与室温处理下青牧一号老芒麦茎长之间的差异不显著。

从图4-c可以看出，同德老芒麦的茎长在低温和室温2个温度处理下，都随着碱胁迫浓度的升高而呈现出降低的趋势。在碱浓度较高(100、200、300 mmol·L-1)时与对照组的茎长差异显著。在相同浓度处理下，碱胁迫浓度为50、100 mmol·L-1的时候，低温处理下的茎长显著高于室温处理下的茎长。

图5 青海草地早熟禾在不同温度和碱胁迫下根尖细胞死亡情况

图6 同德老芒麦在不同温度和碱胁迫下根尖细胞死亡情况

从图4-d可以看出，洽草的茎长在2个温度处理下都随着碱胁迫浓度的升高而降低，都与对照组之间存在显著差异。在碱胁迫浓度高(200、300 mmol·L-1)时，低温处理与室温处理下的洽草茎长之间差异不显著。

2.5 不同温度和碱胁迫对青海草地早熟禾、青牧一号老芒麦、同德老芒麦、洽草的根尖细胞死亡状况的影响

由图5可以看出，青海草地早熟禾的根尖细胞染色情况随着碱胁迫浓度的升高而逐渐加深，其中在室温处理下50和100 mmol·L-1时，颜色较深，说明根尖细胞损伤或死亡的情况较严重。但是低温处理下的颜色较室温处理下的颜色浅。说明低温处理对碱胁迫有一定的缓解能力。图6中，同德老芒麦在100 mmol·L-1时，室温处理的根尖细胞的染色比低温处理的染色深，与对照组相比有明显的区别。在低温处理下，200和300 mmol·L-1时，颜色较深，说明细胞损伤过多或者死亡较多。而在50 和100 mmol·L-1时，颜色较浅，表明根尖细胞死亡或者损伤的情况不严重。图7中，青牧一号老芒麦的根尖细胞在室温与低温处理下，在碱胁迫浓度为300 mmol·L-1时，根尖蓝色明显较对照组加深，且有发黑的现象，表明根尖细胞损伤或者死亡情况严重。说明高浓度的碱胁迫对植物根尖细胞损害严重。图8中，洽草的根尖细胞在100、200 mmol·L-1时，室温处理下的着色情况明显比低温处理下的着色情况严重，说明低温处理下，洽草的根尖细胞死亡或者损伤数比室温处理下的要少。

图7 青牧一号老芒麦在不同温度和碱胁迫下根尖细胞死亡情况

图8 洽草在不同温度和碱胁迫下根尖细胞死亡情况

3 讨 论

碱胁迫对植物的伤害可以大致分为快速的渗透胁迫和此后缓慢的离子毒害[18]。碱胁迫对植物的伤害要远远大于盐胁迫。除渗透胁迫和离子毒害外， 高pH胁迫也是碱胁迫危害植物的机制[19-20]。在碱胁迫下，植物的根系会产生渗透胁迫，植物在胁迫出现时会做出一系列的应答反应，而积累小分子物质是其中一种。植物会在逆境条件下迅速积累如脯氨酸、糖醇等小分子物质来调节植物体内的渗透压，也是通过这种方法来维持植物细胞和组织的正常渗透平衡。可溶性糖也是植物体内一类重要的渗透调节物质，它能够为植物细胞提供能量来源，还可以起到稳定细胞膜和原生质体的作用，甚至在植物体内无机盐离子浓度较高时还能保护酶类[21-22]。通过试验发现：青海草地早熟禾和青牧一号老芒麦在低温条件下，其可溶性糖含量随着碱胁迫浓度的升高均出现先增加后降低的趋势，而同德老芒麦和洽草则出现先降低后增加的趋势，研究结果和马晓林较为一致。多年生牧草耐碱性是多基因控制的数量性状，是多个生理生化机理的综合反映。碱胁迫会对植株造成渗透胁迫然后干扰其营养离子的平衡，从而影响新陈代谢，对植株的生长发育造成一定的响应，导致植株生物量积累降低[23-24]。试验表明：不同温度下高原牧草对同一碱胁迫的响应不同；同一温度下高原牧草对不同碱胁迫的响应也不同。尤为突出的是茎长的变化，茎长随着浓度的升高而逐渐被抑制生长，室温生长下更为明显。本研究发现，随碱胁迫浓度的升高4种牧草根系生长均低于对照(0 mmol· L-1)，特别是在强碱情况下，由于胁迫超过了牧草本身承受的程度，引起根系吸水困难，导致根系细胞脱水严重，在室温下更明显。由此可知低温下更适合种植耐碱牧草。

4 结 论

青海草地早熟禾、青牧一号老芒麦、同德老芒麦、洽草等，在碱胁迫下，通过迅速积累自身可溶性糖来解除氧化胁迫，在一定程度上维持了植物体内渗透平衡，进而提高了植物对碱胁迫的抗逆性。4种牧草在不同温度条件下都具有一定的抗逆性。但总体来说，低温处理条件下的抗逆性要比室温处理条件下的抗逆性更强。也就是说低温处理4种牧草时，牧草对逆境的应答更为积极。结合2种温度和不同浓度碱胁迫下4种牧草生理指标的变化可以看出，青海草地早熟禾在低温处理下，可溶性糖、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)的应答更为显著，在100和200 mmol·L-1时耐碱能力较强。