文蛤红色选育系幼贝滤水率响应面法分析

张志东，陈爱华，吴杨平，张 雨，陈素华，曹 奕，田 镇，张帅中，李秋洁

( 1.江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007； 2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306； 3.中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266003 )

滤水率是指单位时间内贝类滤过水的体积，其不仅可以反映贝类的生长情况，还可以反映贝类的水质净化能力，对贝类养殖及生态调控具有一定的指导意义[1]。目前已见缢蛏(Sinonovaculaconstricta)[2]、大竹蛏(Solengrandis)[3]、青蛤(Cyclinasinensis)[4]、长牡蛎(Crassostreagigas)和海湾扇贝(Argopectenirradians)[5]等滤水率研究的相关报道。文蛤(Meretrixmeretrix)是我国重要的经济贝类之一，与其他双壳贝类相同，拥有强大的滤食能力。由于其独特的摄食机制，常作为水质净化的模式生物[6]。目前，在文蛤滤水率研究方面仅见单一环境因素影响的研究[7-9]，有关环境因素的交互作用对其滤水性的影响尚未见报道。因此，研究文蛤的滤水率，是研究文蛤生长和水质净化能力的基础和前提。

响应面法是一种解决多变量问题的数学统计分析方法，主要通过提供合理的试验设计和数据统计分析、评价多种变量之间的交互作用而建立数学模型和三维立体响应曲面图形，并最终得出最优参数组合的多元回归方程[10]。目前响应面法已经广泛地应用到水产行业中，Jesus等[11]用响应面法研究了温盐的交互作用对水环境及凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)幼体的生长与存活影响，朱晓闻[12]利用响应面法研究了温度、盐度、pH对马氏珠母贝(Pinctadamartensii)稚贝生理学特征的联合效应，姜北等[13]研究了光照度、盐度、pH对大竹蛏滤水率的联合作用。笔者对文蛤红壳色选育系与江苏野生群体在不同单胞藻种类及密度、不同温度和不同盐度条件下的滤水率进行比较，并通过响应面法优化滤水率最高时的养殖条件，旨在为文蛤人工养殖、良种选育和虾—贝循环水养殖模式的建立提供基础信息和理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用文蛤为同池养殖(中间用围网隔开)的红壳色文蛤选育系子四代(以下简称红文蛤)和江苏野生群体(以下简称黄文蛤)。以壳色为明显性状，定期同时测量两种文蛤壳长。红、黄文蛤生物学数据见表1。试验所用藻类为球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)和绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)。

表1 两种壳色文蛤生物学数据

1.2 单因素试验

1.2.1 单胞藻种类及密度对文蛤幼贝滤水率影响试验

从养殖池中挑选规格相近的红、黄两种文蛤进行滤水率试验。试验海水经沙滤和煮沸处理，盐度29，水温21 ℃，pH 8.7，光照度约7000 lx。试验前用上述海水暂养1 d，然后将各450粒的红、黄文蛤置于1000 mL烧杯中进行试验，每个烧杯中放10粒文蛤。根据预试验结果，将球等鞭金藻和绿色巴夫藻的密度梯度设为5×104、10×104、15×104、20×104、25×104个/mL，亚心形扁藻密度2×104、4×104、6×104、8×104、10×104个/mL，并设3组平行。在试验开始时和1 h后用血球计数板计数藻类密度，根据藻类密度变化计算文蛤的滤水率。

1.2.2 温度对文蛤幼贝滤水率影响试验

设置5个温度梯度：18、21、24、27、30 ℃，并设3组平行。室温18 ℃，用加热板水浴调控温度，试验盐度29，pH 8.7，各试验组投喂10×104个/mL球等鞭金藻，试验装置及方法同1.2.1。

1.2.3 盐度对文蛤幼贝滤水率影响试验

设5个盐度梯度：13、17、21、25、29，并设3组平行。根据1.2.2试验结果，用加热板水浴加热，温度调至27 ℃，每个试验组投喂10×104个/mL球等鞭金藻，试验装置及方法同1.2.1。

1.3 多因素试验

在单因素试验的基础上，以文蛤滤水率为指标，运用Box-Behnken模型，选择三因素三水平的中心组合方案，以水体盐度、水体温度和藻类密度(所用藻类为球等鞭金藻)为主要考察因素，进行响应面试验，试验因素水平编码见表2，试验装置及方法同1.2.1。

表2 因素水平

1.4 滤水率的测定

文蛤滤水率(RF)按下式计算[3]：

式中，C0为藻类的起始密度，Ct为试验结束时藻类的密度，t为试验时间，V为试验水的体积，N为试验文蛤的数量。

1.5 数据统计

单因素试验所得数据均用SPSS 19.0和Excel 2016进行统计分析并用Origin 8.0作图。多因素试验用Design-Expert 8.0软件进行响应面法分析。试验结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同藻种类及其密度对文蛤幼贝滤水率的影响

2015年，26岁的青年导演毕赣，凭借其编剧导演的电影《路边野餐》，斩获第52届台湾电影金马奖最佳新导演奖、第68届洛迦诺国际电影节当代电影人单元最佳新导演奖等奖项。3年后，他携新作《地球最后的夜晚》归来。

文蛤幼贝对3种藻类的滤水率在一定密度范围内均呈先增后减的趋势(图1～图3)。球等鞭金藻密度为10×104个/mL时，红、黄两种文蛤滤水率均达到最大，分别为(1.39±0.14) mL/(个·min)和(1.44±0.09) mL/(个·min)；绿色巴夫藻密度为10×104个/mL时，红黄两种文蛤滤水率达到最大，分别为(1.49±0.09) mL/(个·min)和(1.55±0.17) mL/(个·min)；亚心形扁藻密度为6×104个/mL时，红、黄文蛤滤水率最大，分别为(1.31±0.25) mL/(个·min)和(1.41±0.33) mL/(个·min)。方差分析表明，在不同藻类密度下，文蛤滤水率差异显著(P<0.05)，然而红、黄两种文蛤幼贝在相同藻类密度下滤水率均差异不显著(P>0.05)。此外，文蛤幼贝对球等鞭金藻和绿色巴夫藻的滤水率显著高于对亚心形扁藻的滤水率(P<0.05)。

2.1.2 不同温度对文蛤幼贝滤水率的影响

不同温度条件下，红、黄两种文蛤幼贝的滤水率见图4。水温为18～27 ℃时，文蛤的滤水率随温度的升高而升高；在27 ℃时，红、黄两种文蛤滤水率达到最高，均为(1.61±0.20) mL/(个·min)；超过27 ℃后，滤水率呈下降趋势。方差分析表明，温度对文蛤滤水率影响显著(P<0.05)，红、黄两种文蛤在各温度梯度下滤水率差异不显著(P>0.05)。

图1 不同球等鞭金藻密度对文蛤滤水率的影响

图2 不同绿色巴夫藻密度对文蛤滤水率的影响

图4 不同温度对文蛤滤水率的影响

2.1.3 不同盐度对文蛤幼贝滤水率的影响

在不同盐度条件下，文蛤幼贝的滤水率随盐度的增大而增大，当达到一定盐度时，滤水率反而下降。红、黄两种文蛤在盐度为21时滤水率达到峰值，均为(1.74±0.21) mL/(个·min)(图5)。方差分析表明，盐度对红、黄文蛤滤水率的影响显著(P<0.05)，但相同盐度条件下，红、黄文蛤滤水率差异不显著(P>0.05)。

图5 不同盐度对文蛤滤水率的影响

2.2 多因素试验响应面法分析

单因素试验结果显示，红、黄文蛤滤水率在同等条件下有差异，但不显著。结合红文蛤生长快于黄文蛤的结果(图6)，为进一步研究文蛤红壳色选育系的生长性能，选择红文蛤进行多因素养殖条件优化(表3)。利用Design-Expert 8.0统计软件对表3中的试验数据进行分析，得到文蛤稚贝滤水率的二次多项式回归模型的各项系数，文蛤幼贝滤水率预测值(RF)对编码自变量盐度(A)、温度(B)和藻类密度(C)的二次多项回归方程为：

RF=1.85+2.955×10-3A-0.11B-0.032C+0.032AB+0.032AC-0.054BC-0.21A2-0.36B2-0.23C2。

文蛤幼贝滤水率预测值(RF)对实际值自变量盐度(A)、温度(B)和藻类密度(C)的二次多项回归方程为：

RF=-32.07+0.48A+2.09B+0.24C+2.63×10-3AB+1.62×10-3AC-3.61×10-3BC-0.01A2-0.04B2-9.38×10-3C2。

图6 两种文蛤生长数据

表3 试验设计与结果

模型方差分析结果(表4)显示，F=65.96，P<0.0001，模型的相关系数(r2)为0.9883，修正系数(Adj r2)的值为0.9734，表明该模型的拟合度较好，预测值与试验值高度吻合。因此，可用该模型来分析和预测文蛤滤水率的大小。本试验的精确度为22.949%，说明本试验结果可信。另外,由表4可见，温度对文蛤滤水率的线性效应影响显著(P<0.05)，而盐度和藻类密度对文蛤滤水率的线性效应影响不显著(P>0.05)。盐度、温度以及藻类密度对文蛤滤水率的曲面效应影响极显著(P<0.01)，而各两两因素的交互效应影响均不显著(P>0.05)。因此需要将交互作用项剔除，对模型重新进行回归。方差分析结果见表5。此时编码值方程为：RF=1.85+0.024A-0.11B-0.02C-0.21A2-0.38B2-0.24C2。实际值方程为：RF=-32.07+0.48A+2.09B+0.24C-0.01A2-0.04B2-9.38×10-3C2。根据修正后文蛤幼贝滤水率的二次多项式回归方程绘制响应面图见图7。由图7可见，盐度、温度和藻类密度对文蛤滤水率的影响和单因素试验结果一致，均是随着每个单因素的增大，呈现先增后减的变化规律。根据上述所建立的数学模型，得出文蛤滤水率最佳的条件为：盐度21.82，温度27.40 ℃，藻类密度9.96×104个/mL。此条件下文蛤滤水率的预测值为1.62 mL/(个·min)。

3 讨 论

盐度、温度和藻种类及其密度是影响贝类滤水率的关键因素。盐度对贝类渗透压有重要影响，盐度过高或者过低时，贝类会关闭进出水管，紧闭双壳，以保护机体免受侵害。这种情况下，贝类与外界的水流交换和摄食活动停止，滤水率相应下降，盐度适宜时，贝类摄食活动逐渐恢复正常，滤水率随之增大[14]。本研究结果显示，在盐度13～29内，文蛤滤水率呈先增后减的变化规律，在盐度为21时，滤水率达到最大，与上述结论一致。另外，本试验结果表明，温度的一次效应对文蛤幼贝滤水率影响显著(表4)，温度为18～27 ℃，文蛤幼贝滤水率随温度升高而上升，超过27 ℃时，文蛤幼贝滤水率开始下降，27 ℃为文蛤幼贝的最适温度，此时文蛤幼贝滤水率达到最大，为(1.61±0.20) mL/(个·min)。这与大竹蛏[3,13]、长牡蛎[5]、马氏珠母贝[12]等贝类滤水率随温度变化规律一致。Jorgensen等[15]认为，滤食性贝类滤水率呈现上述变化规律有两点原因，一是温度和贝类鳃上侧纤毛的摆动频率呈正相关，温度升高可加快纤毛的摆动频率；二是温度升高可以减小海水的黏滞性，从而增加滤水率。潘鲁青等[2,5]认为，在适宜的温度范围内，温度升高使贝类的代谢能力增强，滤水率上升；而当水温超过一定范围时，贝类生理状态不正常，导致滤水率下降。滤食性贝类对食物的粒径大小有选择性，对小粒径食物的滤食效果要高于大粒径食物[16]。试验结果显示，红、黄文蛤在球等鞭金藻和绿色巴夫藻密度为10×104个/mL、亚心形扁藻密度为6×104个/mL时，滤水率达到最大。本试验所用球等鞭金藻和绿色巴夫藻的粒径为6～7 μm，亚心形扁藻的粒径为11～16 μm，在3种藻类密度均为10×104个/mL时，文蛤幼贝对球等鞭金藻、绿色巴夫藻的滤水率显著高于对亚心形扁藻的滤水率，符合上述规律。另外，在相同藻类不同密度时，文蛤幼贝滤水率也有差异。这与紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)[17]和大西洋浪蛤(Spisulasolidissima)[18]滤水率随藻类密度变化规律一致。产生上述现象的原因可能是：藻类密度过高时，会造成贝类的阻鳃现象，因而滤水率会降低；密度过低时，藻类不及贝类滤食，成为限制贝类滤水率的主要因素[19]。盐度、温度、藻类密度对文蛤幼贝滤水率的曲面效应影响极显著(P<0.01)，而各两两因素的交互效应影响均不显著(P>0.05)。可能与盐度、温度、藻类密度对文蛤幼贝滤水率影响机制不同有关。因此，在实际生产过程中，投喂适量密度的饵料是文蛤高效养殖的关键点之一。

表4 回归模型方差分析

注：r2=0.9883， Adj r2=0.9734，Adeq Precision=22.949%.

表5 修正后模型方差分析

注：r2=0.9796， Adj r2=0.9673，Adeq Precision=23.790%.

图7 交互作用对文蛤滤水率影响的响应面

滤水率不仅可以反映贝类的水质净化能力，还是反映滤食性贝类生长的重要指标之一。试验显示，相同规格红、黄文蛤在同等条件下滤水率无显著差异，但是选育系红文蛤生长显著高于黄文蛤。根据Carfoot[20]的能量收支基本模型：摄食能=粪便能+呼吸能+排泄能+生长能，可知选育系红文蛤在摄食能相同时，其生长能高于野生群体，可推测选育系红文蛤能量利用率高于黄文蛤。比较同等养殖条件下选育系红壳色文蛤和野生群体的生长情况，均得出相似结论[21-22]。

针对贝类滤水率的研究较少考察环境因素的联合作用及曲面效应。试验通过分析盐度、温度和藻类密度的交互作用对文蛤幼贝滤水率构建的Box-Behnken模型拟合度很高，表明该模型能够很好地解释文蛤幼贝滤水率随环境因素的变化。此外，研究文蛤幼贝滤水率的最佳条件时，还应进一步考虑水体pH、文蛤放养密度和规格、底质条件、溶解氧水平等交互作用对滤水率的影响。利用 Design-Expert 8.0统计软件对影响文蛤滤水率的3个因素及其交互作用进行了分析，得出文蛤的最佳滤水率条件：盐度21.82，温度27.40 ℃，藻类密度9.96×104个/mL。然而实际生产中，养殖条件无法做到如此精准，故将养殖条件调整为：盐度21，温度27 ℃，藻类密度10×104个/mL。此养殖条件下实际滤水率(表3)与理论预测值相差不大，说明该模型可靠，可用于实际生产中。