松花粉抗血小板及抗血栓作用研究

李 新,冀 凯,杜世豪,滕 莉,王增阳,刘彦君,齐 栋,范华英

(1.烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005;2.烟台市烟台山医院药剂科,山东 烟台 264000;3.烟台市毓璜顶医院肾内科,山东 烟台 264000)

血栓病是指由于血管内形成异常的血栓使得血流受阻造成机体内各种器官供血受阻而引起的各种脏器机能障碍疾病．血栓形成加速了各种心脑血管疾病的发生和发展[1]．血小板是人体正常凝血机制的关键组成部分,是导致心脑血管疾病的重要原因[2]．随机临床荟萃分析结果表明,抗血小板治疗对血栓栓塞性疾病非常有利,并且能够预防动脉栓塞和静脉血栓栓塞等严重的血管病变[3]．目前临床上使用的抗血小板药物主要包括阿司匹林、氯吡格雷、阿昔单抗等,虽然这些药物可以起到一定的抗血小板作用,但是仍会导致较多的不良反应,包括:出血风险、胃粘膜损伤、造血功能障碍[4]．因此,寻找新的更安全有效副作用低的抗血小板药物具有重要的临床意义．

松花粉(Pine pollen)又名松黄,为松科植物马尾松PinusmassonianaLamb、油松PinustabuliformisCar或同属数种植物的干燥花粉[5]．《神农本草经》里有记载:“松花(粉),气味甘平无毒,主治心腹寒热邪气,利小便,消淤血,久服轻身益气力,延年”[6]．松花粉所含黄酮类物质可有效降低血脂和胆固醇,维持正常血压[7],所含的各种维生素有利于增加血管壁细胞的生长,促进心脏和大脑的血液微循环．松花粉中提取的粗多糖、精致多糖和酚类物质在体外具有较强的抗氧化能力[8]．然而,松花粉是否具有抗血栓及抗血小板作用是未知的．本研究确定了松花粉对血小板聚集、血栓形成和血液循环的作用和机制,从而为松花粉抗血小板和抗血栓作用提供药理学支持．

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性成年SD(Sprague-Dawley)大鼠(体重220±20 g)72只,购自山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司,实验动物合格证No.0003609,许可证号:SCXK(鲁)2014007．所有实验用大鼠均在温度为24±1 ℃和湿度为55%±5%的条件下适应性饲养7 d,并给予自由饮食和饮水．本研究经过烟台大学动物伦理委员会批准,且实验方案符合烟台大学动物伦理委员会的规定．

1.2 实验仪器与设备

LBY-NJ4血小板聚集仪(北京泰利康信科技有限公司),电子计重秤(上海浦春仪器有限公司),电子天平(余姚纪铭称重设备有限公司),TGL-16G台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),多功能酶标仪(美国 Molecular Devices 公司),MVIS-2035全自动血液流变分析仪(重庆天海医疗设备有限公司)．

1.3 药品与试剂

破壁松花粉由烟台新时代健康产业有限公司提供;阿司匹林来源于美国Sigma公司;0.9%氯化钠溶液购自山东科伦药业有限公司;环氧合酶-1(Cyclooxygenase-1,COX-1)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、β-actin购自Santa Cruz Biotechnology Inc.(Dallas,Texas,USA);BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;大鼠血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2)试剂盒、大鼠6-酮-前列腺素F1α(6-keto prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司．

1.4 大鼠急性血瘀模型的制作及指标检测

1.4.1 模型制作 将36只健康雄性成年SD大鼠随机分为6组,每组6只.(1)正常对照组:给予等剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃;(2)血瘀模型组:给予等剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃;(3)阿司匹林组:以0.9%氯化钠溶液为溶媒配制阿司匹林溶液,按照20 mg/kg的给药剂量通过灌胃给药;(4)低剂量松花粉组:以0.9%氯化钠溶液为溶媒配制松花粉溶液,按照0.90 g/kg的给药剂量通过灌胃给药;(5)中剂量松花粉组:按照1.80 g/kg的给药剂量通过灌胃给药;(6)高剂量松花粉组:按照3.60 g/kg的给药剂量通过灌胃给药．所有药物均为每日单次给药,连续给药14 d．第13天除正常对照组之外其余各组大鼠参照文献[9]方法制备大鼠急性血瘀模型,即大鼠以0.8 mg/kg的剂量皮下注射肾上腺素,正常对照组大鼠注射等剂量生理盐水．第一次注射2 h后,除正常对照组外,将其余各组大鼠置于冰水浴中5 min,2 h后再次注射肾上腺素．之后将大鼠放入鼠笼中正常饲养．禁食不禁水12 h后,大鼠末次给药30 min后腹主动脉取血．

1.4.2 血液流变学测定 禁食不禁水12 h后,大鼠末次给药30 min后腹主动脉取血,用肝素抗凝后,检测血液流变学指标:全血粘度包括:高切变率、中切变率和低切变率,血浆粘度,红细胞压积．

1.4.3 体内血小板聚集实验 禁食不禁水12 h后,大鼠末次给药30 min后腹主动脉取血,用3.8%枸橼酸钠抗凝．血液在1 000 r/min下离心6 min,取出上层血浆即为富血小板血浆,余下的部分在3 000 r/min下离心15 min,上层清液即为贫血小板血浆．将血小板数目调至4×108个/mL．用二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)诱导血小板聚集,使用血小板聚集仪测定血小板聚集率,最后结果以最大聚集率表示．

1.5 大鼠动-静脉旁路血栓形成模型制作及指标检测

1.5.1 模型制作 将36只健康雄性成年SD大鼠随机分为6组,每组6只:(1)正常对照组,(2)血栓模型组,(3)阿司匹林组,(4)低剂量松花粉组,(5)中剂量松花粉组,(6)高剂量松花粉组.各组给药情况与“1.4.1”中对应的各组相同,在末次给药30 min后,参照文献[10]方法进行建立大鼠动-静脉旁路血栓形成模型．即大鼠麻醉后,仰卧位进行固定,分离右侧的颈总动脉和左侧颈外静脉,在自制的3段聚乙烯管中放入一根已称重的6 cm的手术丝线．以0.9%的生理盐水充满聚乙烯管,然后将聚乙烯管的一段插入左颈外静脉,另一端插入右颈总动脉．打开动脉夹,使血流从右颈总动脉流经聚乙烯管后,返回左颈外静脉．开放血流15 min后,取丝线称湿重,丝线放室温6 h干燥后,称重记为干重．血栓质量为称得的总质量减去丝线质量．血栓形成抑制率的计算公式如公式(1)所示．正常对照组为假手术组，只分离动脉和静脉,不进行插管．

血栓形成抑制率=

(1)

1.5.2 TXB2和6-keto-PGF1α的含量测定 待大鼠动-静脉旁路血栓形成模型制备完成后,大鼠进行腹主动脉取血．以4 000 r/min的转速离心5 min,收集上清,用于检测TXB2和6-keto-PGF1α的含量．其含量利用ELISA试剂盒检测,实验步骤严格按照试剂盒的说明书进行,含量用pg/mL表示．

1.5.3 Western Blot方法检测松花粉对COX蛋白表达的影响 将形成血栓处的血管段进行组织破碎后加入裂解液(PMSF∶RPMI=1∶100)搅匀后,使用电动匀浆机进行匀浆,直至成混悬液状,匀浆过程在冰水浴中进行．将制得的组织匀浆置于4 000×g的离心力下离心10 min,取上清液至预冷的EP管中,即得到血管总蛋白．使用BCA蛋白浓度试剂盒测量蛋白浓度,以30 μg的上样量求得上样体积．蛋白上样于10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳,电泳完成后转移至PVDF膜,之后置于5%的脱脂牛奶中进行孵育4 h．加入一抗并放在4 ℃过夜,第二天洗涤后加入二抗孵育1.5 h．洗涤后,极超敏ECL化学发光试剂盒检测蛋白条带,并使用ImageQuant LAS 4000拍照处理．

1.6 统计学方法

2 实验结果

2.1 松花粉对大鼠血液流变性的影响

如表1所示,急性血瘀模型组大鼠的全血粘度包括高切变率、中切变率和低切变率以及血浆粘度和红细胞压积均有明显的增高,具有显著性差异,表明造模后大鼠血液处于高凝状态．不同浓度的松花粉能够显著降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积,且呈剂量依赖性．

表1 松花粉对大鼠血液流变性的影响Tab.1 The effects of Pine pollen on the hemorheological parameters in

与对照组相比,#P<0.05,##P<0.01;与血瘀模型组相比,*P<0.05,**P<0.01.

2.2 松花粉体内对血小板聚集的影响

如图1所示,血瘀模型组的血小板聚集率显著高于其他各组,与正常对照组相比,其差异具有统计学意义(P<0.01)．松花粉中、高剂量组可以显著降低血小板聚集率,其中,高剂量松花粉组作用与阿司匹林组作用相当．

2.3 松花粉对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响

通过大鼠动-静脉旁路血栓模型探究松花粉的抗血栓活性,结果如图2所示.与血栓模型组相比,不同浓度的松花粉(0.90,1.80,3.60 g/kg)组的血栓湿重和干重明显降低,且呈剂量依赖性抑制血栓的形成:血栓湿重形成抑制率分别为10.2%,18.0%,23.1%;血栓干重形成抑制率分别为12.4%,25.4%,37.1%．阿司匹林(20 mg/kg)有较强的抑制作用,血栓形成湿重和干重抑制率分别为27.2%,56.0%．

2.4 松花粉对血浆TXB2和6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α的影响

如表2所示,在大鼠动-静脉血栓模型中,模型组大鼠血浆TXB2,6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值明显升高,阿司匹林能够显著降低TXB2,6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值．与模型组相比,不同浓度的松花粉(0.90,1.80,3.60 g/kg)也能够显著降低TXB2,6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值．

2.5 松花粉对COX蛋白表达的影响

使用Western Blot方法研究了松花粉对COX蛋白表达的影响,实验结果如图3、图4所示.与正常对照组相比,血栓模型组COX-1和COX-2的表达明显升高．阿司匹林可以显著降低COX-1和COX-2的表达,而松花粉能够通过选择性地抑制COX-2的表达,而对COX-1的表达没有明显的影响,表明松花粉通过选择性靶向COX-2发挥抗血栓的作用．

表2 松花粉对血浆TXB2和6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α的影响Tab.2 The effects of Pine pollen on plasma TXB2 and 6-keto-PGF1α levels and the ratio of

与正常对照组相比,##P<0.01;与血栓模型组相比,*P<0.05,**P<0.01.

3 讨 论

血栓栓塞性疾病是严重危害公共健康的常见病与多发病．许多疾病与血小板功能障碍有关[11]．但是,很多有效的抗血小板药物在临床上会产生一些副作用,如胃肠道出血．因此,寻找更加安全有效且副作用低的抗血小板药物是亟待解决的问题．本研究通过测定松花粉的血液流变学、抗血小板聚集活性探究其抗血小板及抗血栓作用和作用机制．

为探究松花粉对微循环的影响,该研究通过大鼠急性血瘀模型评估血液流变学参数．血瘀可导致血小板聚集及血液流变学异常,血液流变学异常通常介导许多心脑血管疾病的发生与发展[12]．研究结果显示,与正常组相比,血瘀模型组全血粘度、血浆粘度、红细胞压积均明显增加,结果具有显著性差异．血小板聚集是决定血液粘度的因素之一[13],通过对血小板的聚集率的测定,结果证明松花粉具有明显的抗血小板作用,对ADP诱导的血小板聚集具有明显的抑制作用．松花粉在3.60 g/kg剂量时的抑制作用与阿司匹林20 mg/kg时的作用相当．

该研究通过动-静脉血栓模型研究了松花粉对血栓形成的影响,结果表明松花粉具有一定的抗血栓作用．因此,进一步探讨了松花粉的抗血小板和抗血栓作用的机制．血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)和前列环素(Prostacyclin,PGI2)的平衡是影响血小板功能的主要因素[14]．TXA2是血小板生理激动剂,在体内极不稳定,迅速降解为无活性的TXB2;PGI2是血小板功能抑制剂,在体内很快代谢为6-keto-PGF1α．通过ELISA法检测了动-静脉血栓模型中TXB2和6-keto-PGF1α的含量,以判断TXA2和PGI2的含量．COX存在2种不同的亚型:COX-1和COX-2．COX-1在胃肠道中表达较多,与维持胃肠道内环境稳定和功能密切相关．COX-2的高表达能够促进单核细胞与内皮细胞间粘附,加重炎症反应并通过上调局部基质金属蛋白酶的活性诱发血栓形成[15]．因此,通过Western Blot方法检测了COX-1和COX-2蛋白的表达．结果表明阿司匹林能够显著降低TXB2的含量,非选择性抑制COX-1和COX-2的表达．阿司匹林通过同时抑制COX-1和COX-2的表达发挥抗血小板抗血栓活性,不仅可抑制TXA2的产生,而且抑制PGI2的产生．这种现象称为“阿司匹林困境”[16]．与阿司匹林相比,松花粉可以选择性抑制COX-2的表达,降低TXB2的含量以及使TXB2/6-keto-PGF1α的比值趋于平衡．

综上,本研究结果表明,松花粉具有较强的抗血小板和抗血栓作用．松花粉选择性抑制COX-2的表达并且降低TXB2的含量以及使TXB2/6-keto-PGF1α的比值趋于平衡是其抗血栓作用之一．因此,松花粉在抗血小板和抗血栓治疗中可能会有较好的前景．

4 结 论

本研究证明了松花粉在抗血小板和抗血栓作用中发挥一定的保护作用,并且松花粉对COX-2表达的高度选择性抑制和使TXB2/6-keto-PGF1α的比值趋于平衡的效果优于阿司匹林,为松花粉抗血小板和抗血栓治疗提供一定的药理学支持．