两种灭活方法对2019新型冠状病毒咽拭子标本病毒核酸检测结果的影响

姜蕾 张丽媛 刘大宁★

2019 新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）是一种单链RNA 冠状病毒，基因组序列由29 903 bp 构成，该基因组拥有10 个基因，可以有效地编码10 个蛋白。2019-nCoV 可引起呼吸道感染，目前WHO 已确定其感染所致肺炎统一命名为“新型冠状病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）”。目前，新型冠状病毒肺炎并没有特定的治疗方法，早期诊断与早期隔离是防止疫情扩散的关键，因此，及时筛查出确诊病人是疫情控制的首要任务［1-2］。在最新版本（新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案）的诊疗方案中，新型冠状病毒核酸的检出是确诊依据，荧光定量PCR 技术为新型冠状病毒核酸检测的主要方法［3］。新型冠状病毒具有较强的传染性，在进行核酸检测过程中，实验室的检测人员具有较大的感染风险。本研究比较两种不同咽拭子标本灭活方法对荧光定量PCR 实验结果的影响，为防止实验室内感染和传播，保护实验室检测人员的安全提供有效的安全方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2020年2月1日以来濮阳地区确诊病例3例，依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》和《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》，符合相关流行病学、临床表现，以及咽拭子检测2019-nCoV 核酸阳性。

1.2 试剂和仪器

病毒RNA 提取试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供、荧光定量RT-PCR 试剂由中山大学达安基因股份有限公司（试剂A）和上海之江生物科技股份有限公司提供（试剂B）。RNA 样本保存液由广州邦德盛生物科技有限公司提供。荧光定量PCR 仪为ABI7500（Life Technologies，NY，USA）。

1.3 标本采集与处理

被采集人员先用生理盐水漱口，采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润，被采集人员头部微仰，嘴张大，露出两侧咽扁桃体，将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3 次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3 次，将拭子头浸入含2～3 mL 病毒保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

每份标本分为三组，每组提取140 μL，分别采用三种处理方法，未灭活加入280 μL 生理盐水，56℃灭活30 min 后加入280 μL 生理盐水和加入280 μL 胍盐RNA 保存液灭活。

1.4 核酸提取

中山大学达安基因股份有限公司的核糖核酸（RNA）抽提试剂盒，在生物安全柜内对咽拭子样本进行核酸提取，严格安装说明书上的操作步骤提取病毒提取液。

1.5 上机检测

使用两种不同的核酸检测试剂对样本进行实时荧光定量PCR 检测。

1.6 统计学分析

Graphpad Prism 8.0 软件进行统计学分析。Spearman 相关系数对不同处理的标本CT 值进行相关性分析，采用Bland-Altman 图对CT 值一致性进行分析。

2 结果

2.1 3 组qPCR 结果相关性分析

用试剂A 检测，未灭活组与56℃灭活30 min组CT 值相关性分析，Spearman 相关系数为r=0.9959（P＜0.001）；未灭活组与胍盐RNA 保存液灭活组CT 值相关性分析，相关系数为r=0.9958（P＜0.001）；56℃灭活30 min 组与胍盐RNA 保存液灭活组CT 值相关性分析，相关系数为r=0.9966（P＜0.001），见图1。用试剂B 检测，未灭活组与56℃灭活30 min 组CT 值相关性分析，Spearman 相关系数为r=0.9886（P＜0.001）；未灭活组与胍盐RNA保存液灭活组CT 值相关性分析，相关系数为r=0.9967（P＜0.001）；56℃灭活30 min 组与胍盐RNA保存液灭活组CT 值相关性分析，相关系数为r=0.9915（P＜0.001），见图2。用试剂A 与试剂B 两种不同的试剂同时检测，未灭活组、56℃灭活30 min 组和加入胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果相关性明显。

2.2 3 组qPCR 结果一致性分析

用试剂A 检测，未灭活组与56℃灭活30 min组CT 值差异性分析，偏差=0.3055（图3a）；未灭活组与胍盐RNA 保存液灭活组CT 值差异性分析，偏差=0.2335（图3b）；56℃灭活30 min 组与胍盐保存液灭活组CT 组差异性分析，偏差=0.2640（图3c）。用试剂B 检测，未灭活组与56℃灭活30 min组CT 值差异性分析，偏差=0.1643（图4a）；未灭活组与胍盐RNA 保存液灭活组CT 值差异性分析，偏差=0.06325（图4b）；56℃灭活30 min 组与胍盐保存液灭活组CT 组差异性分析，偏差=0.1472（图4c）。Bland-Altman 分析结果显示，用试剂A 与试剂B 两种不同的试剂盒同时检测，未灭活组、56℃灭活30 min 组和加入胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果具有较好的一致性。

图1 未灭活组，56℃30 min 加热灭活组与胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果相关性分析（试剂A）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit A）

图2 未灭活组，56℃30 min 加热灭活组与胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果相关性分析（试剂B）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit B）

图3 未灭活组，56℃30 min 加热灭活组与胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果一致性分析（试剂A）Figure3 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit A）

图4 未灭活组，56℃30 min 加热灭活组与胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果一致性分析（试剂B）Figure4 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit B）

2.3 不同检测试剂对同一种标本处理方法下检测结果一致性分析

试剂A 与试剂B 检测结果CT 值差异性分析，偏差=1.031（图5）。Bland-Altman 分析结果显示，两种试剂盒检测同一标本，qPCR 结果具有良好的一致性。

图5 两种检测试剂对同一标本处理方法下检测qPCR结果一致性分析Figure5 Consistency analysis of qPCR results between the two test reagents treated the same specimen

3 讨论

新型冠状病毒属于β 属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或者椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm。其基因特征与SARA-CoV 和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS 样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上。对冠状病毒理化特征的认识多来自对SARA-CoV 和MERS-CoV 的研究。病毒对紫外线和热敏感，56℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒，氯已定不能有效灭活病毒。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径［4］。在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。检验人员在做好生物安全防护外，在不影响结果的前提下，若能在检测前将标本进行灭活处理，将大大降低感染的几率［5］。本研究通过2019新型冠状病毒样本核酸提取前，用两种不同灭活方法分别处理咽拭子标本，对荧光定量PCR 检测结果进行统计学分析。

本研究选用两种灭活方法处理咽拭子标本，56℃30 min 加热灭活和胍盐病毒保存液灭活。胍盐可使蛋白质变性，溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。胍盐可对新型冠状病毒2019-nCoV 临床样本进行蛋白质变性而起到灭活作用，大大降低了检验过程中的生物传染风险。胍盐不仅具有沉淀蛋白质的作用，还具有抑制核酸酶的作用，从而保证释放出来的核酸不被降解。

本研究用两种新型冠状病毒核酸检测试剂同时检测，Spearman 相关系数对不同处理的标本CT值进行相关性分析后得出，未灭活组、56℃灭活30 min 组和加入胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果相关性明显。Bland-Altman 分析结果显示，未灭活组、56℃灭活30 min 组和加入胍盐RNA 保存液灭活组qPCR 结果具有良好的一致性。

综上所述，56℃灭活30 min 组和加入胍盐RNA 保存液灭活对于检测2019-nCoV 核酸结果无影响，可在检测前灭活以降低检验人员感染风险。在后续的研究中，需加大标本量，将有助于进一步明确不同灭活处理对于检测结果的影响。