鹿筋胶原蛋白提取条件优化

张鹏程， 幺宝金， 冷向阳

(长春中医药大学，吉林 长春 130021)

鹿筋最初记载于《唐本草》[1]，为鹿科动物梅花鹿或马鹿四肢的筋，用于治疗肾虚引起的手足无力、风湿关节痛、劳损、转筋等症。现代药理学研究表明，鹿筋胶原蛋白具有抗炎、镇痛、增强机体免疫力、治疗骨质疏松等作用。鹿筋的主要成分是胶原蛋白，胶原蛋白的水解产物含多种氨基酸，所以更丰富了鹿筋的药用及食用价值。胶原蛋白(collagen)是一种生物性高分子物质，是一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质。胶原蛋白主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，是这些结缔组织的主要物质基础。

胶原蛋白是最丰富的蛋白质之一，可以从多种动物身上提取[2]。目前对于胶原蛋白提取的主要方法有：酸提取法、碱提取法、酶提取法、酸酶结合提取法、碱酶结合提取法等[3]。该研究在半仿生学状态下对其鹿筋胶原蛋白的提取条件进行优化。人体内的胃酸主要是0.2%～0.5%的HCL，胃蛋白酶及胰蛋白酶为人体主要的消化酶，胃蛋白酶的最适宜温度为37 ℃，pH值约2.0～3.0，胰蛋白酶的最适宜温度为37 ℃，pH值约7.0～8.0。该研究选择酸—酶结合提取法做为试验的主要方法，旨在得到纯度更高的鹿筋胶原蛋白，为后续相关工作打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂、仪器

梅花鹿鹿筋购自吉林省长春市双阳区鹿乡镇；胃蛋白酶(1∶3 000)、胰蛋白酶(1∶250)、1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值8.8)、1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值6.8)、10 % SDS、30%制胶液(29∶1)购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自碧云天生物公司；过硫酸铵溶液(AP，10%)购自上海原液生物科技公司；4×Laemmli Sample Buffer购自Bio-Rad美国；Cell Counting Kit-8购自BOSTER公司；Infnite200 PRO型酶标仪购自Life Sciences公司；pH仪购自Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 鹿筋的处理

取新鲜鹿筋，剔除肌肉组织、脂肪组织、筋膜等其他组织，保留新鲜鹿筋原料，并将剔好的鹿筋用剪刀或手术刀切成0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的鹿筋颗粒，置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 鹿筋胶原蛋白的提取方法

将鹿筋解冻，醋酸溶液浸泡后置于100 ℃沸水浴中至其完全溶解，将水解液于20 ℃条件下9 500 r/min离心15 min；离心后取上清液调节pH值为2.0，向上清液中加胃蛋白酶，放置37 ℃摇床酶解；酶解后得到胶原蛋白粗液，90 ℃加热10 min，使胃蛋白酶失活；20 ℃、9 500 r/min 离心15 min，取上清液经冷冻干燥得到胶原蛋白。每组试验3次重复。

1.2.3 胶原蛋白提取的评定指标

不同醋酸体积分数、煎煮时间、浸提时间等均会对鹿筋胶原蛋白提取造成影响。酸量过少、煎煮时间不足、浸提时间短会使胶原蛋白提取时不易溶解，从而影响回收效率；酸量过大、煎煮时间过长均会造成胶原蛋白中一些氨基酸变性，而且酸浓度过大会引入过多的离子；酸浓度适当时，鹿筋在100 ℃ 沸水中溶解较快而且比较充分并且回收效率较高。因此，醋酸浓度、煎煮时间、浸提时间以鹿筋冻干回收率作为评价指标。

1.2.4 胶原蛋白含量的测定

应用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)完成。标准曲线的绘制：将 0、1、2、4、8、12、16、20 μL标准品加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20 μL，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20～30 min。用酶标仪测定595 nm处的光密度值。以蛋白浓度/mg·mL-1为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 SDS蛋白电泳

样品制备 称取适量样品，溶解至50 mg/mL，按照1∶3加入4×Laemmli Sample Buffer，混匀，100 ℃沸水煮5 min。存放于-20 ℃冰箱中保存。配制10%分离胶及12%压缩胶于1.5 mm制胶板中，每孔加40 μL样品。S1压缩胶时间为30 min，S2分离胶时间为50 min。将完成的电泳胶放入容器盒中倒入染色液，放入37 ℃、70 r/min摇床中染色1 h，用配制好的脱色液(225 mL甲醇、225 mL超纯水、50 mL乙酸)脱色2次，每次30 min；将胶片放在白色背景板下观看。

1.2.6 单因素试验

1.2.6.1 不同醋酸体积分数对提取的影响

称取21 g 鲜鹿筋平均分成7份，每份3 g，按料液比1∶50加入配制好的体积分数为0、0.5%、1%、3%、5%、8%、10%的醋酸溶液。置于4 ℃、120 r/min 摇床振荡48 h，然后取出恢复室温后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，根据鹿筋冻干后回收率确定最佳醋酸体积分数。

1.2.6.2 不同煎煮时间对提取的影响

称取15 g鲜鹿筋平均分成5份，每份3 g，加入配制好的体积分数为5%的醋酸溶液。 置于4 ℃、120 r/min 摇床振荡48 h，然后取出恢复室温后置于100 ℃沸水中提取，煎煮时间为1、1.25、1.5、1.75和2 h，根据鹿筋冻干后回收率确定最佳煎煮时间。

1.2.6.3 不同浸提时间对提取的影响

称取15 g鲜鹿筋平均分成5份，每份3 g，加入配制好的体积分数为5%醋酸溶液。置于4 ℃、120 r/min摇床振荡6、12、24、48和72 h，然后取出恢复室温后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，根据鹿筋冻干后回收率确定最佳浸提时间。

1.2.6.4 不同酶的种类对提取的影响

称取9 g鲜鹿筋平均分成3份，每份3 g，加入配制好的体积分数为5 %的醋酸溶液。置于4 ℃、120 r/min 摇床振荡48 h，然后取出恢复室温后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，分别做不加酶处理，用浓HCL调节pH值至2.0加胃蛋白酶及用10 mol/L NaOH调节pH值至7.5胰蛋白酶处理，酶解12 h根据鹿筋冻干后回收率确定酶的选择。

1.2.6.5 不同酶底比对提取的影响

称取18 g 鲜鹿筋平均分成6份，每份3 g，加入配制好的体积分数为5 %的醋酸溶液。 置于4 ℃、120 r/min 摇床振荡48 h，然后取出恢复室温后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，调节pH值至2.0，把胃蛋白酶配成一定浓度的溶液，然后按照酶和底物的比例分别为0∶1(不加入胃蛋白酶)、1∶300、1∶500、1∶1 000、1∶1 500和1∶2 000(g/g)加入胃蛋白酶溶液，酶解12 h，根据鹿筋冻干后回收率确定最佳酶底比。

1.2.6.6 不同酶解时间对提取的影响

称取12 g鲜鹿筋平均分成4份，每份3 g，加入配制好的体积分数为5 %的醋酸溶液。 置于4 ℃、120 r/min 摇床振荡48 h，然后取出恢复室温后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，调节pH值至2.0，按照酶底比分别加入1∶1 000的胃蛋白酶，分别酶解6、12、18和24 h，根据鹿筋冻干后回收率确定最佳酶解时间。

1.2.7 正交试验

根据单因素试验结果，对醋酸体积分数(A)、浸提时间(B)、煎煮时间(C)3个因素，每个因素3个水平采用L9(33)正交表进行试验验证，对鹿筋胶原蛋白提取条件进行优化。

1.2.8 细胞增殖活性试验

应用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8)完成。传代培养MC3T3成骨细胞，获得细胞悬液，按照3×104个/mL(每孔100 μL)接种于96孔细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，将过膜除菌后的鹿筋提取物按如下浓度梯度溶于DMEM培养液中：0、4、5、6、7、8、9和10 mg/mL；按照100 μL/孔将不同浓度药物加入96孔板中，放置培养箱中继续培养24 h，避光条件下向每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8试剂，再次孵育30 min，应用酶标仪检测450 nm处吸光度，计算细胞增殖率。

1.2.9 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。所有数据皆为3次试验的平均值和标准差。各组间比较采用成组t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 醋酸体积分数的确定

由图1可知，随着醋酸体积的增加，鹿筋的回收率会随之增加，在醋酸体积分数为5 %时，回收率最高，因此，选用醋酸体积分数为5 %。

2.1.2 煎煮时间的确定

煎煮1.25 h时鹿筋可充分溶解，由图2可知，煎煮1.25 h与煎煮1.75 h收率相差无几，故选用最佳煎煮时间为1.25 h。

图2 不同煎煮时间对鹿筋回收率的影响

2.1.3 浸提时间的确定

由图3可知，随着浸提时间的增加，鹿筋胶原的回收效率也随之增加，当达到48 h时达到峰值，因此，选择48 h为最佳浸提时间。

图3 不同浸提时间对鹿筋回收率的影响

2.1.4 酶种类的确定

根据图4可知，加入胰蛋白酶与未加酶的相比较，回收率基本一样，且加入胰蛋白酶会引入大量的盐，加入胃蛋白酶回收率会显著增加，因此，选择加入胃蛋白酶。

图4 不同酶的种类对鹿筋回收率的影响

2.1.5 不同酶底比的确定

由图5可知，按照酶底比1∶1 000加入胃蛋白酶的鹿筋回收率较高，因此，选择1∶1 000胃蛋白酶为最佳酶底比。

图5 不同酶底比对鹿筋回收率的影响

2.1.6 不同酶解时间的确定

由图6可知，酶解6 h时，鹿筋回收率较高，因此，最佳酶解时间为6 h。

图6 不同酶解时间对鹿筋回收率的影响

2.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，确定正交试验的因素与水平(表1)。正交试验结果及方差结果见表2、3。

表1～3的结果表明，极差R值显示不同醋酸体积分数、浸提时间、煎煮时间单因素对鹿筋提取含量的影响程度不同，作用主次分别为 C>A>B；即煎煮时间>不同醋酸体积分数>浸提时间。经方差分析F值分析可知，不同醋酸体积分数、浸提时间、煎煮时间这3个因素对鹿筋胶原的提取效果不具有显著性差异，所以最佳提取工艺为A2 B2 C3。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析结果

2.3 正交试验电泳结果

蛋白电泳可以提示应用酸酶结合的方法，提取出来胶原蛋白(图7)。图中蓝色印记越深，代表蛋白含量越高，试验所提取的蛋白主要集中在15～35 kDa，说明蛋白水解充分，大多数都水解成为小分子蛋白。提取方法有效可行。

注：从左至右分别为Marker、正交试验序号1、2、3、4、5、6、7、8、9。

图7 正交试验电泳结果

Fig.7 Results of orthogonal test electrophoresis

2.4 细胞增殖活性试验

以0 mg/mL作为空白对照，利用CCK-8试剂检测鹿筋胶原在不同浓度下干预MC3T3细胞24 h后的增殖活性，鹿筋胶原蛋白在给药浓度到4 mg/mL时，细胞开始增殖，到8 mg/mL时达到峰值，超过8 mg/mL时增殖趋势下滑(图8)。各加药组与空白对照组之间通过t检验计算MC3T3处理的存活率差异。鹿筋胶原在8 mg/mL时，差异极显著(P<0.01)。因此，可以确定8 mg/mL是最佳活性浓度。

注：*代表P<0.05，**代表P<0.01。

3 讨论与结论

古代药典及中医经典古籍对于鹿筋的记载相对较少，主要由于古代其野生性，物品稀缺及处理复杂，无法广泛使用。目前，在人工饲养后，鹿产品的产量被大大的提高，鹿筋做为一个食材为主、药用为辅的材料也广泛被认知及应用。现代药理研究表明，鹿筋胶原蛋白的抗炎[4]、镇痛[5]效果显著、在增强机体免疫力[6]方面也有显著的效果。胶原蛋白具有复杂的层次结构，可分为4种结构[7]。 到目前为止，大约有28种类型的胶原[7]已经被鉴定出来，I型胶原最普遍的类型，特别是在肌腱和骨骼等组织中[7-8]。I型胶原的缺失可导致成骨不全及许多退行性疾病[9]。II型胶原是软骨组织中存在的主要胶原类型[10]。胶原蛋白在生物医学中主要有皮肤替代品[11]、骨修复[12]、腱修补[13]、软骨修复[14]、神经修复[15]等应用。

张鹤[16]、陈海燕[17]等对鹿筋胶原进行提取时，以鹿筋在100 ℃沸水中的溶解时间做为提取胶原的评价指标，采用Folin-酚试剂盒测胶原蛋白含量，得到的鹿筋胶原提取条件与本研究略有差别。该研究主要以胶原的回收效率做为衡量的标准，并且在进行冻干时，并未调整pH值至中性条件，避免了酸碱中和产生的大量的盐，所以得到的回收率会更加准确。另外，BCA蛋白浓度测定试剂盒的敏感度也会略高于Folin-酚试剂盒，对于小分子蛋白的测定也会更加准确。该研究与其不同点在于应用回收率衡量酶量，所得结果与高效益相色谱所得到的结果一致，这样既缩短了实验时长，又减少了高效液相繁琐的操作步骤，为实验提供了便利。前两者的研究均以酶解24 h做为最佳酶解时间，而该研究以回收率做为衡量标准的同时，又考虑环境因素对胶原带来的影响，37 ℃的环境有极大的可能会导致样品出现变质的可能，所以该研究把酶解时间缩短到6 h。

MC3T3细胞是小鼠胚胎成骨细胞，是体外研究骨细胞分化的良好模型。试验中通过胃蛋白酶制取的鹿筋胶原蛋白对MC3T3细胞有明显的增殖效果，说明鹿筋有一定的强筋健骨之功。骨质疏松症主要是由于成骨细胞与破骨细胞的平衡关系被打破[18-19]，以至于破骨细胞过于活跃，骨质溶解过多，而胶原蛋白对成骨细胞的增殖作用可以有效地促进成骨增殖分化，有效缓解骨质疏松症的发展进程，对骨质疏松症的治疗起到一定的作用。

根据单因素试验及正交试验验证得出最佳工艺条件为：醋酸体积分数5% ，浸泡时间48 h，煎煮时间1.5 h，胃蛋白酶用量1∶1 000，酶解时间6 h。试验中采用胃蛋白酶制备的鹿筋胶原蛋白多肽，对MC3T3细胞均具有显著的增殖作用，由此可以说明鹿筋胶原蛋白多肽具有鹿筋原药材的强筋壮骨等功效。但对MC3T3细胞增殖的机理还有待于进一步研究。该研究对于具有补肝肾、强筋骨的鹿产品研发提供了数据。