低温胁迫下优质稻种芽期耐冷性及不同时期抗氧化酶活性研究

邓 鑫， 王 亮， 徐伟豪， 白学峰， 张基德*， 具红光*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133000；2.延边朝鲜族自治州农业科学院，吉林 龙井 133400)

延边朝鲜族自治州位于吉林省的东部，地处中、朝、俄3国交界，其山区、半山区水稻面积占延边水稻面积的40%[1]；因面临日本海及鄂霍次克海，受西伯利亚冷空气的影响，冷害时常发生，其危害的严重性和广泛性给当地水稻的种植和生产带来了巨大的影响，遇冷害年水稻减产30%，甚至更高，给当地水稻产业带来严重损失。通过对水稻芽期的耐冷性研究，采取相应的技术措施，可大幅度减少水稻芽期冷害造成的损失[2-3]。

芽期耐冷性是幼芽细胞维持生活的能力，从外观上表现为幼芽诱发绿苗的能力[4]。低温是影响水稻种子发芽成苗的主要因素之一[5]，容易在水稻播种开始，到第1片完全展开叶这个过程中，延长了水稻出芽时间，或者导致烂秧现象[6]，造成成苗率下降。芽期耐冷性的强弱直接决定了该品种是否适用于寒地种植[7]。

冷害是低温对植物体的生理性损伤，造成活性氧的数量增加，损伤程度除了取决于低温胁迫的强度外，还取决于低温维持的时间长短[8]。通过SOD、CAT、POD等酶可清除植物体内过量的活性氧，使植株免受或少受活性氧伤害，因此它们是植物重要的耐冷保护酶系统[9-10]，3种酶的协同作用，能使自由基维持一个较低的水平，提高水稻植株的抗寒能力[11]。

该试验主要针对延边黑土稻区水稻生产现状，减少水稻各时期冷害造成的经济损失，引进省内外优质新品种，通过鉴定耐冷性，测定各生理指标变化，分析品种间差异，筛选出适宜黑土稻区种植的耐冷优质品种，为促进水稻可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 芽期耐冷性筛选

1.1.1 材料

试验材料为吉林省内外的丰产优质品种：上育397、龙稻17、龙稻18、吉农大538、九稻68、吉粳302、通系935、通禾66、吉粳511、吉粳515、通育266、吉粳809、延粳22、吉玉粳、通35，共计15个。由选育单位提供后，经32 ℃浸种催芽，以保证所有品种材料发芽率都在95%以上。

1.1.2 方法

1) 发芽期耐冷性评价 将供试水稻种子在50 ℃恒温下处理48 h，使其充分干燥和打破休眠。每份材料挑选饱满种子，均匀放置于垫有滤纸的培养皿中，加入少量水浸种24 h后，再用自来水洗涤2～3次，分别放入14 ℃恒温箱中低温培养，每个样品50粒，3次重复。低温培养设置2种时间方式，分别为培养7 d和培养14 d，各培养方式结束后，调查种子发芽率，评价耐冷性[12]，评价标准见表1[5-6]。

表1 发芽期耐冷评价标准

2) 芽期耐冷性评价 每份材料挑选饱满种子，种子干燥和浸种方法同1.1.2.1，于32 ℃恒温箱催芽。当芽长约5 mm时取出分别置于3和5 ℃低温培养箱处理10 d。处理结束后，将培养皿放在20 ℃以上并有光照的室内，使水稻芽恢复正常生长。10 d后，调查死苗数，评价耐冷性[12]，评价标准见表2[5,13]。

表2 芽期耐冷性评价标准

1.2 不同时期抗氧化酶的测定

1.2.1 材料

在芽期耐冷性筛选的基础上，从上述15份芽期耐冷性筛选品种中挑选5个品种(龙稻18、九稻68、通系935、吉粳511和通育266)，分别进行低温胁迫后不同生育时期超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等耐冷性生理指标的测定。并以相应供试品种的未低温胁迫处理为对照(CK)，共10个处理,各处理分别为A.自然生长龙稻18(对照)；A1.低温胁迫龙稻18；B.自然生长九稻68(对照)；B1.低温胁迫九稻68；C.自然生长通系935(对照)；C1.低温胁迫通系935；D.自然生长吉粳511(对照)；D1.低温胁迫吉粳511；E.自然生长通系266(对照)；E1.低温胁迫通系266。生理指标测定法采用《植物生理生化实验原理和技术》[14]。

1.2.2 苗期抗氧化酶的测定

将催芽的种子播种于装有苗床土的育苗盘中，每份材料播15粒，以2 cm距离点播，行距3 cm，3次重复。在20～30 ℃的温室育苗。在3.5叶龄期，移至人工气候箱进行5 ℃的低温胁迫处理，每天光照12 h、黑暗12 h，处理7 d，光照模仿自然低温阴雨天。7 d后取样，液氮冷冻后放入超低温冰箱-80 ℃保存，用于测定超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)。

1.2.3 分蘖期、减数分裂期、灌浆结实期抗氧化酶的测定

供试品种按常规法育苗，苗后移栽至直径38 cm，高40 cm的盆内，每盆栽种4穴，每穴3株基本苗，重复3次。氮、磷、钾施用量按纯量计分别为120、80和80 kg/hm2。各品种不同生育时期低温胁迫方法为：1) 分蘖期：将缓苗7 d后的盆栽苗放置于12 ℃的条件下低温培养，处理时间为6 d，培养结束时取样测定相关酶活性；2) 减数分裂期：将到达减数分裂期的植株在16 ℃低温培养，处理5 d后取样测定；3) 灌浆结实期：将到达灌浆结实期的植株在14 ℃低温培养，处理10 d后取样测定。光照、取样及测定方法同1.2.2。

1.3 统计分析

采用Microsoft Excel 2003软件进行表格制作及相关系数计算，品种间各抗性生理指标的差异显著性分析采用DPS V9.01数据处理系统。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对不同品种发芽期耐冷性的影响

由表3可知，低温发芽7 d后，各品种发芽率存在极显著差异(F=33.96**)，九稻68发芽率最高(25.33%)，显著高于其他各品种，但此期所有品种的耐冷性级别均为极弱。

低温发芽14 d后，各品种间发芽率差异极显著(F=163.01**)，龙稻18、九稻68、通禾66和吉粳511发芽率达到84%以上，显著高于其他品种；龙稻18和通禾66耐冷性极强，九稻68和吉粳511耐冷性强，而其余品种耐冷性属于弱或极弱范畴。

表3 低温胁迫下各品种的发芽率和耐冷级别

注：同列数据不同小写字母、大写字母分别表示处理间差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)，下同。

2.2 低温胁迫对不同品种芽期耐冷性的影响

在3 ℃低温胁迫下，不同品种死苗率差异极显著(F=24.01**)(表4)，上育397死苗率最低，与其他品种死苗率存在显著或极显著差异。在此温度处理下上育397和吉粳809耐冷性为强，龙稻18、吉粳302、通禾66、吉粳511、延粳22、吉玉粳耐冷性为中，其余品种耐冷性为弱。在5 ℃低温胁迫下，不同试验品种死苗率差异显著(F=2.19*)，延粳22死苗率最低，较吉粳511、通35差异极显著，较吉玉粳差异不显著，较其余品种差异显著；所有品种芽期耐冷性为强。

表4 低温胁迫对芽期耐冷性比较

2.3 不同品种不同时期低温胁迫抗氧化酶活性的变化

2.3.1 不同品种不同生育时期低温胁迫后SOD的变化

由表5可知，各品种经低温胁迫的处理与自然生长处理间的SOD活性存在显著差异(P<0.05)。处理品种中，除了苗期处理的九稻68、灌浆结实期处理的龙稻18外，其他低温胁迫后的各处理SOD酶活性均高于对照组；与对照组相比，各处理SOD酶活性增强幅度差异极显著(P<0.01)，龙稻18、九稻68、通系935随着生育进程呈先上升后下降的趋势，吉粳511、通系266随着生育的进程呈先下降后上升的趋势，低温处理后大体呈分蘖期酶活性增幅最大；苗期通育266 SOD酶活性增幅最大，九稻68 SOD酶活性增幅最小，分蘖期通系935 SOD酶活性增幅最大，吉粳511 SOD酶活性增幅最小，减数分裂期龙稻18 SOD酶活性增幅最大，吉粳511 SOD酶活性增幅最小，灌浆结实期吉粳511 SOD酶活性增幅最大，龙稻18 SOD酶活性增幅最小。

2.3.2 不同品种不同生育时期低温胁迫后CAT的变化

由表6可知，在低温胁迫下，低温胁迫处理与自然生长处理间的CAT活性存在显著差异(P<0.05)，各低温胁迫处理中除B1在苗期CAT酶活性最高外，其余均在减数分裂期酶活性达到最高。在除减数分裂期、灌浆结实期中的九稻68处理外，其他品种经低温胁迫处理的CAT酶活性均高于对照组；与对照组相比，各处理CAT酶活性增强幅度差异极显著(P<0.01)，龙稻18、吉粳511、通育266随着生育时期的进程呈先上升后下降再上升的趋势，九稻68、通系935随着时期的进程呈先下降后上升的趋势，低温处理后大体呈分蘖期酶活性增幅最大；苗期九稻68 CAT酶活性增幅最大，龙稻18 CAT酶活性增幅最小，分蘖期通系935 CAT酶活性增幅最大，通育266 CAT酶活性增幅最小，减数分裂期龙稻18 CAT酶活性增幅最大，九稻68 CAT酶活性增幅最小，灌浆结实期吉粳511 CAT酶活性增幅最大，九稻68 CAT酶活性增幅最小。

表5 不同品种低温胁迫后各生育时期SOD活性Table 5 SOD activity of fertility period of different varieties after low temperature stress (U· g-1)

表6 不同品种低温胁迫后不同时期CAT活性

Table 6 CAT activity of fertility period of different varieties after low temperature stress (U·g-1·min-1)

处理低温胁迫时期苗期分蘖期减数分裂期灌浆结实期 处理27.40 c27.67 d32.73 d25.46 bcdA30.76 b32.96 a34.48 a26.90 aA112.24 D19.12 D5.35 A5.63 B增幅/%20.86 f26.63 e34.07 ab26.82 aB32.79 a32.62 ab31.46 e26.31 abB157.19 A22.50 C-7.66 C-1.90 C增幅/%23.81 e25.19 f32.62 d24.57 deC32.34 a27.85 d32.98 cd26.30 abC135.78 B10.55 E1.11 B7.07 AB增幅/%25.88 d23.98 g33.45 abcd22.96 fD32.75 a31.64 b33.45 abcd25.15 cdeD126.55 C31.94 B0.01 B9.55 A增幅25.84 d22.14 h33.19 bcd24.28 eE32.07 a30.44 c33.88 abc25.60 bcE124.11 C37.45 A2.08 B5.42 B

2.3.3 5个品种不同时期低温胁迫后POD变化规律

由表7可知，在低温胁迫下，低温胁迫处理与自然生长处理间的POD活性存在显著差异(P<0.05)。处理品种中，除了苗期处理的九稻68、通系935外，其他品种经低温胁迫处理的POD酶活性均高于对照组；与对照组相比，各处理POD酶活性增强幅度差异极显著(P<0.01)，龙稻18随着时期的进程呈先下降后上升再下降的趋势，九稻68随着时期的进程呈先上升后下降再上升的趋势，通系935、吉粳511、通系266随着时期的进程一直呈上升的趋势，低温处理后大体呈灌浆结实期酶活性增幅最大；苗期龙稻18 POD酶活性增幅最大，九稻68 POD酶活性增幅最小，分蘖期九稻68 POD酶活性增幅最大，吉粳511 POD酶活性增幅最小，减数分裂期通系935 POD酶活性增幅最大，九稻68、通育266 POD酶活性增幅最小，灌浆结实期通系935 POD酶活性增幅最大，龙稻18 POD酶活性增幅最小。

表7 不同品种低温胁迫后不同时期POD活性

Table 7 POD activity of fertility period of different varieties after low temperature stress (U·g-1·min-1)

处理低温胁迫时期苗期分蘖期减数分裂期灌浆结实期 处理1.11 d2.96 de0.37 d1.85 dA2.59 bcd5.00 d2.59 c2.59 cdA1133.33 A68.75 D600.00 B40.00 E增幅/%2.22 bcd1.85 e0.74 d3.70 cB1.48 cd14.44 c1.48 cd8.52 bB1-33.33 E680.00 A100.00 D130.00 C增幅/%4.44 a5.19 d0.74 d0.37 eC3.70 ab22.59 b10.37 a12.59 aC1-16.67 D335.71 C1 300.00 A3 300.00 A增幅/%2.22 bcd2.59 e0.74 d1.85 dD2.96 bc3.70 de1.48 cd3.70 cD133.33 B42.86 E100.00 D100.00 D增幅2.22 bcd5.19 d0.74 d1.48 dE2.59 bcd31.48 a4.81 b12.59 aE116.67 C507.14 B550.00 C750.00 B

3 讨论与结论

九稻68在14 ℃处理7 d的发芽率最高，但发芽率不足30%，造成发芽率低的原因，主要源于积温的不足[15-16]；龙稻18、九稻68、通禾66、吉粳511在14 ℃处理14 d后发芽率较高，发芽期表现出较强的耐冷性，说明这几个品种在遇到低温时，如果保持积温足够，仍然具有较好萌发的能力，生产稳定性较好。

上育397、吉粳809在芽期3 ℃处理后的死苗率较低，芽期的耐冷性为强，而龙稻18、吉粳302、通禾66、吉粳511、延粳22和吉玉粳的死苗率较高，芽期的耐冷性中等，在实际生产中，一般很少会遇到持续低温(3 ℃)10 d的情况，因此，这几个品种试验下耐冷性中等的品种，在生产中仍能保持较好的生产稳定性。

该试验结果表明，在SOD、CAT、POD活性方面，5个品种随着生育时期的进程，大体呈先上升后下降的趋势，对照组酶活性均有着不同程度的改变，处理酶活性有着不同程度的提升，整体在苗期、分蘖期酶活性变化幅度最大，其中在苗期吉粳511酶活性较强，分蘖期中通育266酶活性较强，减数分裂期中龙稻18酶活性较强，灌浆结实期中吉粳511、通育266酶活性较强；通育266在芽期有着较强耐冷性，在后期保护酶的测定上仍具有较强的抗氧化能力，是一个较为耐冷的品种。

通过该试验研究，部分品种的SOD或CAT酶活性较强，POD酶活性较弱，部分品种的SOD和CAT酶活性较强，POD酶活性较弱，部分品种的POD酶活性较强，SOD或CAT较弱。与陈海燕、王琴[17-18]的试验中部分品种靠1种或2种酶的提升来抵御逆境生长的结论相一致。另外，SOD和CAT 2种酶对低温胁迫比较敏感，在低温条件下，两者趋势变化比较相似，POD的酶活性并未出现太大变化，这很可能是植物适应低温胁迫对代谢的代偿调节功能的体现[19]。因此，耐冷性较强的品种SOD、CAT、POD 3种酶活大小与植株耐冷性有着显著的相关性[20]，在代谢过程中，引起其他代谢途径或过程受抑制或降低，是植物适应逆境的一种积极的策略[21-22]。

水稻耐冷性为复杂的数量性状，受多基因控制，是一个复杂的生理过程，该试验仅对所试验品种的芽期耐冷性及不同生育时期抗氧化酶等指标进行了分析，未来有必要针对更多生育阶段或更多生育指标进一步深入研究。