骨肉瘤患者新辅助化疗后治疗反应的病理组织学评估

宫丽华 刘巍峰 李兰 董荣芳 张文 张婷婷 牛晓辉 丁宜

骨肉瘤是最常见的好发于青少年的骨原发性恶性肿瘤，发病高峰年龄为 10～20岁[1]。组织学上以典型的恶性肿瘤细胞直接成骨为特征。最常见转移部位为肺。一旦发生了肺转移，患者进入 Enneking III 期，导致治疗困难及预后不良。化疗药物的应用显著促进了骨肉瘤的外科手术治疗进程[2]，最近几十年，由于新辅助化疗与手术治疗的结合，其5年无瘤存活率由新辅助化疗应用前的 20% 提高到60%～80%[3]。各种骨肿瘤专业书籍和指南均认可术前化疗 ( 新辅助 ) 的效果评价是提示骨肉瘤预后的重要指标之一[1]。由于临床及影像学评估意义有限，目前仍依赖于病理镜下组织学的评估。因此，新辅助化疗后骨肉瘤评估治疗反应时的标本取材、镜下形态观察及新辅助治疗后组织学改变评分的标准化操作就显得十分重要。为此，笔者对本院 296例新辅助化疗后骨肉瘤的肿瘤患者的治疗反应，进行了回顾性组织学评估，现介绍如下。

资料与方法

一、纳入标准与排除标准

1. 纳入标准：( 1) 2014年 10月至 2018年 10月，就诊于本院的骨肉瘤患者；( 2) 在本中心行穿刺化疗前活检和最终肿瘤切除手术者；( 3) 病理诊断明确为高级别骨肉瘤者；( 4) 临床及影像学资料完整者；( 5) 患者知情并同意行术后病理坏死率评估者。

2. 排除标准：( 1) 术前仅有外院会诊病理的高级别骨肉瘤者；( 2) 未行术前新辅助化疗的截肢患者；( 3) 未行术后标本标准坏死率评估者；( 4) 无化疗前后连续影像学评估资料者。

二、临床资料

本研究共纳入 296例，女 100例，男 196例。年龄 8～49岁，平均 16岁。其中股骨 181例，胫骨 71例，肱骨 25例，腓骨 9例，桡骨 4例，髂骨4例，锁骨 1例，尺骨 1例。

三、操作方法

本组所有标本，术后均经 2位病理医师复核确立诊断。骨肉瘤化疗后大体标本治疗反应取材具体操作步骤如下：( 1) 骨肿瘤标本沿长轴锯开取最大径薄片 ( 薄片厚度约 0.5cm )，薄片应包括肿瘤主体和周围组织，以及邻近的皮质、骨膜、骨髓、关节软骨及软组织交界区域等。经 4% 中性缓冲甲醛液固定；( 2) 大体标本照相，并复习手术前影像学资料核对肿瘤位置及大小；( 3) 对薄片标本进行脱钙处理。经 98% 甲酸与 4% 中性甲醛按以 1∶1比例配制脱钙液，对标本进行脱钙处理；( 4) 脱钙完成后，对薄片进行“网格”样分割，按每 1cm 取材一块划分，并逐一编号 ( 图 1)；( 5) 取材部分应包括累及软组织的部分，肿瘤与正常组织交界处等。石蜡包埋，3µm 切片并常规 HE 染色；( 6) 镜下进行逐块评估，计算每块的治疗反应 ( 即坏死所占比例 )，最后汇总数据。

四、评估标准

随着新辅助化疗方案在临床的应用，由 Huvos等[4]和 Rosen 等[5]倡导的化疗后手术标本取材和评估分级被全世界肿瘤中心所采纳，该操作按照 CAP标准 ( 文献 ) 主要由病理科完成，按照 Huvos 分级标准得出评估结果。Huvos 分级标准包括以下四级：Grade I：肿瘤细胞没有或几乎没有坏死；Grade II：肿瘤细胞坏死超过 50%，某些切片中可以见到存活的肿瘤细胞；Grade III：肿瘤细胞坏死超过 90%，某些切片中可以见到灶状存活的肿瘤细胞；Grade IV：任何切片中均未见到存活的肿瘤细胞。大多数研究化疗与预后关系的数据表明，Grade I 与 Grade II 化疗效果不好 (＜90% )，Grade III 与 Grade IV 化疗效果好 ( ≥ 90% )。由于好的化疗反应具有更高的无病生存率[6]，因此，本研究将以 90% 为界进行治疗反应的评估。在镜下观察时，完全无肿瘤细胞存在的正常组织将不包含在总体治疗反应的计算中。

五、坏死率的评估

以图 1为例，本例标本共取材 87片，49片中未见肿瘤细胞，有 38片中可见肿瘤细胞。38张切片中的正常组织排除在外，计算每张切片肿瘤细胞的坏死占肿瘤组织的比例：从 50%～95% 不等，对这 38个数据进行总和取平均值，即为最后整体组织的化疗坏死率，本例坏死率计算结果 78%。按照Huvos 分级记为＜90%。

结 果

一、新辅助化疗后病理评估

本组所有患者均行术前新辅助化疗，化疗方案为甲氨蝶呤、异环磷酰胺、阿霉素和顺铂四药序贯进行。其中 99例见皮质破坏并伴有软组织包块。治疗反应 Huvos 分级 ≥ 90% 为 140例，＜90% 为 156例。101例组织形态中可见肿瘤性软骨成分，其中31例总体治疗反应 ≥ 90%，余 70例均＜90%。

二、镜下形态

图1 新辅助化疗后手术大体标本地图样分格取材Fig.1Gross specimen after new adjuvant chemotherapy

在坏死率 ≥ 90% 的病例中，大部分肿瘤区域的肿瘤细胞消失，代之以纤维血管组织，间质疏松水肿，纤维母细胞增生伴有胶原形成，其间可见反应性的较成熟的新骨，骨周见骨母细胞围绕。纤维组织内可见出血，或表现为灶、片状出血，或表现为血管扩张、瘀血 ( 图 2)。纤维组织及坏死组织内散在退变的瘤细胞：核大，深染，核形态不规则，染色质结构不清，部分胞质红染，可见瘤巨细胞及多核瘤细胞 ( 图 3)。大片坏死的肿瘤细胞也可表现为鬼影细胞形态。由于瘤细胞受化疗的影响而骨样基质依然存在，花边样肿瘤骨周围可见高度异型的肿瘤细胞 ( 图 4)。在治疗反应＜90% 的病例中，可见灶片状存在的瘤组织，细胞形态可受化疗影响而呈现细胞核的改变 ( 图 5)。小细胞骨肉瘤化疗后可见小圆形的骨肉瘤细胞，细胞周围见幼稚的花边样肿瘤骨 ( 图 6)。毛细血管扩张型骨肉瘤可见囊性结构，囊壁内见肿瘤性新生骨，细胞伴退变性改变 ( 图 7)。成软骨为主型骨肉瘤中，软骨成分不受化疗影响，可见软骨呈结节状 ( 图 8) 或片状存在( 图 9)。成纤维为主型骨肉瘤化疗后可见瘤细胞以梭形为主 ( 图 10)，化疗反应好的区域瘤细胞消失，代之以玻璃样变性的粗大胶原纤维，残存瘤细胞呈现化疗后改变。

图2 纤维化组织中见出血、血管扩张及反应性新骨形成 ( HE × 10)图3坏死瘤组织内见核退变的瘤细胞 ( HE × 40)图4花边状骨周围见核退变的瘤细胞 ( HE × 40)图5化疗反应较差的瘤组织显示细胞存活 ( HE × 20)图6小细胞骨肉瘤化疗后细胞核固缩，细胞周围见幼稚的骨样基质 ( HE × 20)图7毛细血管扩张型骨肉瘤化疗后改变 ( HE × 40)图8成软骨为主型骨肉瘤中的结节状软骨几乎不受化疗影响 ( HE × 20)图9成软骨为主型骨肉瘤中的片状软骨几乎不受化疗影响 ( HE × 20)图10成纤维型骨肉瘤显示梭形的存活瘤细胞 ( HE × 20)Fig.2Bleeding, vasodilation, and reactive new bone formation in fibrotic tissues ( HE × 10)Fig.3Tumor cells with nuclear degeneration in necrosis tissues ( HE × 40)Fig.4Ιrregular tumor tissues surrounded by degenerated tumor cells ( HE × 40)Fig.5Surviving tumor cells in the poor response areas ( HE × 20)Fig.6Karyopyknosis was observed after chemotherapy and the immature osteoid existed in small osteosarcoma ( HE × 20)Fig.7Features of telangiectatic osteosarcoma after chemotherapy ( HE × 40)Fig.8Nodular cartilage without chemotherapy reactions in chondroblastic osteosarcoma ( HE × 20)Fig.9Cartilage flakes without chemotherapy reactions in chondroblastic osteosarcoma ( HE × 20)Fig.10Surviving spindle tumor cells after chemotherapy in fibroblastic osteosarcoma ( HE × 20)

讨 论

治疗反应基于化疗后坏死肿瘤细胞与存活肿瘤细胞的比例，用于评价对化疗药物的敏感性。在治疗中存活的细胞被认为是药物抵抗性的，即化疗抵抗性细胞。当前，评价骨肉瘤预后的因素包括年龄、性别、肿瘤位置、大小及临床分期等，但最重要的指标是肿瘤组织对术前化疗的反应[7-10]。Bacci等[11]对 789例肢体骨肉瘤经新辅助化疗后的预后因素进行了评估，发现治疗的差反应是非转移性肢体骨肉瘤预后评估中非常有价值的独立因素。在高级别骨肉瘤的亚型中，成纤维型骨肉瘤与毛细血管扩张型较骨母细胞型与成软骨型骨肉瘤的化疗反应更好[12]。尽管如此，研究表明成软骨为主型与更好的长期存活率相关[13-14]。本研究发现，对于普通型骨肉瘤中以成软骨为主时，由于成软骨肿瘤细胞对化疗的不敏感性，化疗过程中并不坏死，因此肿瘤性软骨的存在及其量的多少将影响总体治疗反应评估。本组的组织形态中包含软骨的 101例骨肉瘤患者，70% 的患者对治疗的反应＜90%，提示软骨在治疗反应高低的评价中占一定的作用。

病理解剖和外科病理主任协会 ( association of directors of anatomic and surgical pathology，ADASP )于 2004年规范了骨肉瘤化疗的疗效评判标准[15]。由于尤文氏肉瘤及骨的恶性纤维组织细胞瘤与骨肉瘤的生存率、治疗及治疗后反应相似，故此评判标准也适用于这两种肿瘤。治疗反应以坏死所占所有肿瘤面积的百分数表示。研究显示化疗诱导的坏死达到或超过 90% 以上则具有 90% 的无病存活率，而低于 90% 则无病存活率降至 15% 以下[16]。

一、推荐取材方法

最初的取材方法曾推荐将肿瘤标本全部取材或者三维立体取材等，显然这些方法繁冗而不现实，在繁忙的现代医学中心几乎无法完成。后来随着经验和数据的积累，且经过欧美很多肿瘤中心反复尝试，推荐一种比较简单的骨肉瘤新辅助化疗后手术标本取材标准方法。即：对大体标本沿最大径取代表性的一个薄片，约 5mm 厚，进行分格画图并标号以显示每一块所在的位置，其中不仅包括肿瘤组织，也包括可能被化疗效果所屏蔽的周围软组织、肿瘤结节、皮质骨、皮质下髓腔、软骨以及韧带等。最后经脱钙后取材 1块 / cm。同时，应该详细描述标本的大小 ( 长径与最大横径 )、肿瘤的大小、位置、有无皮质的侵犯及软组织包块形成、髓腔侵犯程度、是否累及骺软骨、关节软骨以及有无骨内跳跃灶。

二、推荐判读方法

对于肿瘤坏死的界定具有一定的困难和主观性。ADASP 指南中指出骨母细胞型及成软骨为主型中，瘤细胞的缺失，仅在骨样基质及软骨样基质中留下空的陷窝提示为化疗后肿瘤坏死。成软骨为主型骨肉瘤中，常可见“鬼影细胞”，残存瘤细胞核固缩或呈边界不清的嗜碱性。在成纤维型或小细胞骨肉瘤中，与尤文氏肉瘤相似，其肿瘤坏死表现为细胞性成分被纤维组织及肉芽组织取代，可伴慢性炎细胞浸润。毛细血管扩张型骨肉瘤化疗后显示残存充满血液的囊壁成分，散在含铁血黄素沉积，可见残存异型细胞。在化疗后切片中，总能见到一些细胞：核显著异型性，染色质团块状，胞质空泡状，其往往仅占切片面积的小部分，究竟是对化疗反应的一种体现还是反应性表现，目前意义不明。为尽可能降低评估的主观性，这种细胞被认为是存活的肿瘤细胞。因此，在评估治疗反应时，不考虑细胞形态改变，仅评判瘤细胞存在与否[17-19]。在鉴别肿瘤的原发性坏死与化疗后坏死几乎不可能，指南推荐如果肿瘤坏死同时存在纤维母细胞增生及含铁血黄素沉积，则认为是化疗后反应。在受侵犯的软组织、皮质、关节软骨、韧带中，常可见到存活的肿瘤细胞，而坏死更多集中于肿瘤的中心部位。对于这种坏死分布的倾向性，Picci 等[20]认为肿瘤的血管是主要因素。与肿瘤内部大量的新生血管相比，软骨、皮质及周围韧带、软组织中的血管相对不丰富，因此难以产生高浓度化疗药物蓄积，故使肿瘤细胞得以存活。

三、推荐评价系统

除了 Huvos 评分系统外，目前对于化疗后组织学评估还存在其它评价系统，如 Rosen 等[5]、Wold[18]、Picci 等[20]及 Raymond 等[16]分级，除了Raymond 对坏死率进行粗略定量外，其余几种皆对坏死后比例进行分级，将其分为 4～5级。Rosen 评分 I 级极少或无化疗后坏死；II 级部分反应，＜50%坏死；III 级＞90% 坏死；IV 级无存活细胞。Picci 评分：好：＞90% 坏死；中：60%～90% 坏死；差：＜60% 坏死。Wold 评分：I：无效果；II：部分坏死 ( 包括 A：＞50% 存活细胞；B：5%～50% 存活细胞 )；III：散在存活细胞 (＜5% 存活细胞 )；IV：无存活细胞。目前，Huvos 评分系统被世界各地医学机构较为广泛接受。

此外，骨肉瘤化疗后病理报告应该包括以下信息：手术标本类型是截肢术还是保肢术；标本的解剖部位；肿瘤大体特征包括肿瘤的位置、大小 ( 长径及横径 cm )、距离断端的距离；与邻近组织的关系包括骺软骨、关节软骨；皮质骨、周围软组织及可能的淋巴结，有无跳跃灶。镜下形态包括肿瘤组织学分型、组织形态描述，坏死比例及边缘情况。

通过对骨肉瘤患者治疗反应后的组织学评估，可以对骨肉瘤化疗后反应做出反馈，提示临床医师化疗药物的筛选是否合理，同时也是患者预后评估的重要依据。

四、局限性

虽然本研究进行了大量骨肉瘤术后标本的坏死率评估分析，但仍存在如下不足：( 1) 本组病例目前为止跟踪随访时间未到 5年，缺乏标准生存率的数据，根据化疗后反应评估结果与患者预后进行有效统计学分析，了解二者之间的关系目前还无法完成；( 2) 对于病理坏死率和化疗后影像学评估尚未建立关联机制，如能够将影像学评估参数与病理评估进行结合，更能给临床提供判断权重，并且寻找二者一致性和异质性评价；( 3) 未对不同手术方式及外科边界与病理坏死率进行分组分析，临床治疗抉择与坏死率的关系未进一步阐述；( 4) 病理坏死率的评价方式目前还是比较单一，对于真实世界数据的评估，有待于不断完善参数的引入，以期能够不断修正和辅助临床的判断和治疗。