内蒙古鄂尔多斯市野生羊肚菌ITS初步鉴定

庞 杰，刘 海，康立茹，于传宗，王海燕，李亚娇，孙国琴

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.食用菌内蒙古自治区工程研究中心，内蒙古 呼和浩特 010031；3.鄂托克旗草原工作站，内蒙古 乌兰镇 016100）

羊肚菌（Morchella esculenta）隶属于子囊菌门（Ascomycota） 盘 菌 纲（Pezizomycetes） 盘 菌 目（Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌属（Morchella），是世界公认的一类珍贵、稀有食（药）用真菌，在欧洲被认为是仅次于块菌的美味食用菌[1]。在北美洲、亚洲（中国、日本、印度、朝鲜）和欧洲均有分布，在我国的分布范围比较广泛，主要分布在西南、中原、华中、华东区域。目前，关于内蒙古地区野生羊肚菌研究尚属空白。

羊肚菌属根据形态特征被划分为四大类群：黑色羊肚菌类、黄色羊肚菌类、半开羊肚菌类和变红羊肚菌类[2-4]。现代分子系统发育分析认为，羊肚菌属由黄色羊肚菌（Esculenta）支系、黑色羊肚菌（Elata）支系和变红羊肚菌（Rufobrunnea）支系构成，半开羊肚菌类被划分到黑色羊肚菌支系中[5-6]。杜习慧等[7]将我国羊肚菌分布划分为六个区域，其中欧亚草原亚区和中亚荒漠亚区的羊肚菌有待调查和研究。内蒙古地处我国北疆，生态类型多样，生物多样性丰富。笔者在内蒙古鄂尔多斯市进行野外食用菌资源调查中发现了野生羊肚菌的分布，并且鄂尔多斯地区地处欧亚草原亚区和中亚荒漠亚区交汇地区，目前上述地区羊肚菌鉴定工作尚属空白。因此，该项研究工作的开展填补了内蒙古羊肚菌鉴定的空白。

1 材料和方法

1.1 材料

羊肚菌子实体采集于内蒙古鄂尔多斯市独贵塔拉镇附近，采集时间为2016年4月，标本保藏于内蒙古自治区农牧业科学院蔬菜研究所（图1）。

1.2 羊肚菌菌种分离

分离方法和培养基配方参见文献［8］。

1.3 DNA 提取、ITS 扩增及测序

DNA 提取采用CTAB 法[9]，PCR 反应体系参考王凯[10]所采用的方法。PCR 引物为ITS1/4，由上海生工生物工程有限公司合成；ITS 测序由北京博迈德基因技术有限公司完成。

1.4 数据处理

测序数据提交NCBI 数据库和羊肚菌多基因序列模标数据库（Morchella MLST 数据库），获得比对数据；采用MEGA v7.0.14 软件进行系统发育树的构建及遗传距离的计算，遗传距离采用邻接法（Neighbor-joining methhod）。

2 结果与分析

2.1 ITS 测序NCBI 数据库比对结果分析

将培养的菌丝体提取DNA 并经过PCR，交测序公司进行测序。测定的样品子实体rDNA ITS 序列长度为1 185 bp，其中CG 为54.43%，测序质量优良，将测得的序列提交至NCBI 数据库，获得序列号为MN872380。

将测序获得的碱基序列提交至NCBI 数据库进行比对（2019年12月27日），共计获得100 个比对结果，最大评分范围为1 884～1 029；同源性范围为97.97%～88.19%。进一步对100 个比对结果进行分析，结果将目标羊肚菌分在8 种类型中（表1），剔除无法获得准确名称的Morchella sp. 和Uncultured Morchella，目标测序结果（MN872380）可能的学名为M. spongiola、M. esculenta、M. prava、M. dunensis、M. vulgaris、M. crassipes。

表1 ITS 序列在GenBank 中比对结果（2019-12-27）

进一步选用NCBI 数据库51 个有确定拉丁学名的DNA 序列结果，采用遗传距离的计算（邻接法，Neighbor-joining methhod）进行系统发育树的构建及遗传距离的计算。结果表明，目标测序结果（MN872380）单独成一类，与其他相关的DNA 序列结果都不接近（图2）。

2.2 Morchella MLST 数据库比对结果分析

为了进一步确定目标测序结果（MN872380），将ITS 测序结果提交至Morchella MLST 数据库[7]进行比对，获得50 个比对结果，评分范围为1 586.55～1 228.35，相似性范围为98.03～94.20，重叠百分比范围为90.13%～73.92%。进一步对50 个比对结果进行分析，结果将目标羊肚菌分在4 种类型中（表2），剔除无法获得准确名称的Morchella sp.，目标测序结果（MN872380）可能的学名为M. spongiola、M. prava、M. esculenta。

进一步选用Morchella MLST 数据库27 个有确定拉丁名的DNA 序列结果，采用MEGA v7.0.14 软件对其进行系统发育树的构建及遗传距离的计算（邻接法）。结果表明，目标测序结果（MN872380）与KM485935、JQ691480、EU834822 和EU834821 分在一类（图3）。

表2 ITS 序列在Morchella MLST 数据库中比对结果（2019-12-27）

3 结论与讨论

羊肚菌属由黄色羊肚菌（Esculenta）支系、黑色羊肚菌（Elata）支系和变红羊肚菌（Rufobrunnea）支系构成[5-6]。WIPF 等[11]对黄色羊肚菌和黑色羊肚菌的ITS 序列进行了研究，发现黑色羊肚菌的ITS 序列长度为740～750 bp，黄色羊肚菌的ITS 序列长度为1 150～1 220 bp，本次采集的羊肚菌ITS 序列长度为1 185 bp，因此推断为黄色羊肚菌支系。

进一步对两个数据库进行比对，虽然通过Morchella MLST 数据库比对结构构建系统发育树中将目标测序结果（MN872380）与KM485935、JQ691480、EU834822 和EU834821 分 在 一 类，但是，有同一类拉丁学名并不统一，相同拉丁学名也在不同类别当中出现的问题。并且在NCBI 数据库中进一步检索KM485935、JQ691480、EU834822和EU834821 的相关信息，无法获取准确地采集地等信息。综上所述，鄂尔多斯地区分布有黄色羊肚菌类（yellow morels），但其拉丁学名尚不能通过单一的ITS 确认，目标测序结果（MN872380）的拉丁学名确定，仍需要进一步采取LSU、EFla、RPB1 和RPB2 等多基因联合分析才能完成[12]。