肝癌组织中PKM2表达及与放疗敏感性的关系

马 欢，芦东徽，徐 滨，徐明静，胡 勇，潘跃银

肝癌是临床上最为常见的恶性肿瘤之一。据统计，2018年全球有62.6万以上的新发肝癌病例，发病率位居恶性肿瘤的第5位，病死率位居第3位[1]。近年来，我国肝癌的发病率呈逐年增长趋势，目前每年约有35万新发肝癌病例，且病死率高[2]。三维适形放疗是肝癌患者临床常用的治疗措施，其疗效与患者对放疗的敏感性紧密相连。M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase, PKM2)主要位于细胞质，在肿瘤细胞中该蛋白的表达水平较高，可参与基因转录调控和细胞内信号转导[3]。有研究证实[4]，肝癌组织中PKM2蛋白表达与患者预后密切相关，但该蛋白表达与放疗敏感性关系的文献鲜有报道。鉴于此，本实验收集80例肝癌患者的临床资料，旨在探讨肝癌组织中PKM2表达与放疗敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2012年2月～2018年10月中国人民解放军联勤保障部队第901医院肿瘤科诊治的80例肝癌患者。病例纳入标准：(1)均行肝脏穿刺活检术且均病理检查证实为肝癌；(2)均实施三维适形放疗；(3)均未接受其它种类抗肿瘤治疗；(4)均有完整的临床资料；排除标准：(1)复发性或转移性肝脏恶性肿瘤者；(2)伴有重要脏器功能障碍者；(3)合并精神障碍者；(4)合并认知障碍或沟通障碍者；(5)存在严重外伤者。80例中男性45例，女性35例，年龄41～76岁，平均(56.96±6.82)岁，临床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期22例、Ⅲ期36例、Ⅳ期16例。分化程度参照Edmondson-Steiner分级标准，低分化(近似来源组织的不成熟形态)21例、中分化(分化程度低，但明确保留起源组织的特点)30例、高分化(分化程度高，接近来源组织的成熟形态)29例。本次实验经中国人民解放军联勤保障部队第901医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法检测肝癌组织中PKM2蛋白表达 染色步骤：常规脱蜡、水合、切片、固定、水化，抗原热修复，滴加一抗，剂量为50～100 μL，4 ℃孵育过夜，以PBS缓冲液冲洗后滴加通用型鼠/兔聚合物，剂量为50 μL，37 ℃湿盒孵育20 min，显色。以苏木精复染，加入盐酸分化，自来水冲洗返蓝。脱水后封固，在镜下观察组织中蛋白表达，以细胞质出现棕色或棕黄色染色为蛋白阳性，将蛋白阳性率>10%者记为阳性。

1.2.2 三维适形放疗法 采用CT扫描，层厚和层距均设置3.0 mm。将扫描结果传输至三维适形治疗计划系统，勾画靶区，观察图像并确认肿瘤体积后输入数据，计划靶体积为肿瘤体积外放1.0～1.5 cm。使用直线加速器15MV-X射线照射，每次剂量为2 Gy，每天1次，每周5次，总照射剂量为60 Gy。

1.3 观察指标 (1)统计本组患者肝癌组织中PKM2蛋白的表达。(2)对比不同PKM2蛋白表达患者放疗前后血清AFP水平差异，采用酶联免疫吸附试验检测。(3)对比不同PKM2蛋白表达患者放疗效果，参照实体瘤疗效判定标准，完全缓解、部分缓解者均记为放疗敏感；稳定、进展者均记为放疗不敏感，且完全缓解与部分缓解例数总和构成比为缓解率。(4)分析PKM2蛋白表达与放疗敏感性的关系。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料比较采用t检验；计数资料以百分数描述，等级分布比较以秩和检验；采用Logistic回归分析探讨PKM2蛋白表达与放疗敏感性的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织中PKM2蛋白的表达 80例肝癌组织中PKM2蛋白阴性10例，阳性70例，阳性率为87.50%(70/80)(图1～4)。

①②③④

图1 肝癌(Ⅲ期)组织中PKM2蛋白阴性，EliVision法 图2 肝癌(Ⅳ期)组织中PKM2蛋白弱阳性，EliVision法 图3 肝癌(Ⅱ期)组织中PKM2蛋白中等阳性，EliVision法 图4 肝癌(Ⅳ期)组织中PKM2蛋白强阳性，EliVision法

2.2 不同PKM2蛋白表达患者放疗前后血清AFP水平 放疗前后肝癌组织PKM2蛋白阳性者血清AFP水平均高于阴性者(P<0.05)，且放疗后血清AFP水平均低于放疗前(P<0.05，表1)。

表1 不同PKM2蛋白表达患者放疗前后血清AFP水平

2.3 不同PKM2蛋白表达患者放疗效果 PKM2蛋白阳性者放疗效果等级分布与阴性者对比差异有统计学意义(Z=6.783，P=0.009)，且PKM2蛋白阳性者缓解率(放疗敏感率)明显低于阴性者(χ2=6.445，P=0.011，表2)。

2.4 PKM2蛋白表达与放疗敏感性的关系 放疗不敏感患者临床分期、分化程度、PKM2蛋白表达与放疗敏感者对比差异均有统计学意义(P<0.05，表3)，且均是放疗不敏感的独立危险因素(P<0.05，表4)。

表3 放疗敏感患者与不敏感患者可能因素的构成比[n(%)]

表4 Logistic回归分析

3 讨论

研究表明[5]，除病理特征可能会影响肝癌患者放疗敏感性外，细胞增殖与凋亡调控相关基因也是此类患者放疗敏感性的重要影响因素。另有研究表明[6]，肝癌组织中PKM2蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织，且其表达水平也可影响恶性肿瘤细胞的增殖及肿瘤生长。

表2 不同PKM2蛋白表达患者放疗效果[n(%)]

本实验结果显示，肝癌组织中PKM2蛋白阳性率为87.50%，呈高表达，与Yang等[7]的报道相符。另外，PKM2蛋白阳性者放疗前血清AFP水平高于阴性者，放疗后均下降，且放疗后前者仍高于后者，可知PKM2蛋白阳性者血清AFP水平高，虽经化疗可控制血清AFP水平，但化疗后相较于PKM2蛋白阴性者，阳性者血清AFP水平仍较高。血清AFP是原发性肝癌常见的肿瘤标志物之一，与临床分期密切相关，且其水平越高，患者预后越差。PKM2蛋白是肿瘤组织有氧酵解过程中的关键酶，其表达水平越高，糖酵解代谢为肿瘤细胞生长和增殖提供的能量越多，肿瘤细胞快速分裂和增殖的物质基础也越多[8]。在肝癌患者中应当积极控制PKM2蛋白的表达水平，控制肿瘤细胞生长和增殖所需的能量、原料供应。

此外，本实验亦发现，肝癌组织中PKM2蛋白阳性者缓解率(放疗敏感率)明显低于阴性者，可知肝癌组织中PKM2蛋白阳性者放疗不敏感的可能性大，放疗效果不甚理想。探讨PKM2蛋白表达与放疗敏感性的关系，结果显示临床分期Ⅲ期、临床分期Ⅳ期、低分化、PKM2蛋白阳性均是放疗不敏感的独立危险因素(OR=3.274、5.328、5.942、7.135，P<0.05)，可知上述因素均可影响放疗敏感性，导致疗效不理想。既往有报道证实[9]，临床分期Ⅲ期、临床分期Ⅳ期、低分化均可影响放疗敏感性，与本实验结果一致，原因可能为：临床分期越高，患者病情越严重，且体质越差，可能影响放疗敏感性；分化越低，肝癌的恶性程度越高，疾病进展越快，因而放疗敏感性越差。此外，推测PKM2蛋白表达越高，为恶性肿瘤细胞生长和增殖所需的能量、原料供应量越充足，因而放射线杀灭恶性肿瘤细胞的难度越大，放疗不敏感的风险也越高。因此，在临床实践中应积极控制PKM2蛋白的表达，尤其是对于低分化的肝癌患者应加强重视，合理采用辅助治疗措施方可达到理想效果。

综上所述，在肝癌组织中PKM2蛋白表达水平高，与血清AFP水平、放疗效果紧密相联，且PKM2蛋白阳性等均是影响放疗敏感性的危险因素，针对上述因素均应积极防控，以提升放疗效果，改善患者预后。