通过式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中地西泮

宿书芳, 孙立臻, 薛 霞, 公丕学, 魏莉莉, 李新玲, 祝建华, 刘艳明*, 张 峰

(1. 山东省食品药品检验研究院， 山东 济南 250101; 2. 中国检验检疫科学研究院食品安全所, 北京 100123)

地西泮(diazepam, C16H13ClN2O)又名安定,属于苯二氮卓类镇静剂,具有镇静、抗惊厥等作用(其结构式见图1)，畜牧生产中经常被用作动物生长促进剂,以达到镇静催眠、促进生长和增重催肥的目的。近年来,一些不法商贩擅自在水产动物捕捞和运输过程中非法使用地西泮,导致其在水产品中残留,人体长期摄入这类水产品,中枢神经系统会受到严重干扰。因此镇静剂类药物被许多国家列为水产动物捕捞和运输过程中禁用药物。我国农业部235号公告已明确规定在动物性食品中不得检出地西泮;农业部176号公告也规定严禁在饲料和动物饮用水中使用地西泮等精神类药物。

图 1 地西泮的化学结构式Fig. 1 Chemical structure of diazepam

目前关于地西泮的研究报道大多集中在畜肉[1-5]、饲料[6,7]、保健食品[8]和血液、尿液等生物制品[9,10],也有少数学者对水产品中镇静剂进行研究[11-13]。报道的主要检测方法有液相色谱法[14,15]、液相色谱-串联质谱法[16-20]和气相色谱-质谱法[5,21]等。其中,液相色谱法灵敏度相对较低,难以满足禁用物质的检测要求;气相色谱-质谱法一般需要衍生,前处理过程复杂;液相色谱-串联质谱法因其具有较高的灵敏度,抗干扰能力强及不需要衍生等优点,在兽药残留分析中应用最为广泛。现行标准[22]是唯一可适用于水产品中地西泮的检测标准,但实际检测过程中发现,该方法存在回收率低、重现性差等问题。因此建立水产品中地西泮精准、高效的检测方法意义重大。

水产品富含蛋白质、不饱和脂肪酸等多种营养成分,基质复杂,地西泮在水产品中是否与组织结合目前尚存在争议[12,13,23]。选择高效提取、净化的技术,是实现痕量残留物有效提取与精准定量的前提。常见前处理技术有酶解、萃取等,采用的净化方式有固相萃取[16,17,24]和QuEChERS[3,11,20,25]净化。除了QuEChERS,传统固相萃取净化均需经过活化-上样-淋洗-洗脱-氮吹等步骤,实验操作繁琐耗时。Prime HLB固相萃取柱是新一代的通过式固相萃取吸附剂[26-28],其特有的亲脂基团可以有效地吸附水产品中的蛋白质和磷脂类物质,较以往固相萃取剂具有更简单、更高效、更洁净的优势。

本研究比较了地西泮在水产品中的存在形式、提取条件,考察了采用Prime HLB固相萃取与QuEChERS两种净化方式的净化效果,建立了以乙腈直接提取,Prime HLB固相萃取净化,液相色谱-串联质谱检测水产品中地西泮的测定方法。该方法试剂用量少,检测周期短,准确度高,能满足批量水产品中地西泮的快速准确检测需求。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

液相色谱-三重四极杆质谱仪,具有电喷雾电离(ESI)源(AB Sciex 5500,美国AB Sciex公司);超高效液相色谱仪(AQUITY UPLC I-Class)、Prime HLB净化柱(60 mg/3 mL和200 mg/3 mL)、QuEChERS净化管(含900 mg MgSO4、150 mgN-丙基乙二胺(PSA)、150 mg C18)(美国Waters公司);去离子水发生器(IQ 7000,美国Millipore公司);氮气吹干仪(N-EVAP48,美国Orangaomation公司);离心机(3-18K,德国Sigma公司);涡旋混合器(MS3,德国IKA公司);针式滤器(有机相,0.22 μm,上海安谱实验科技股份有限公司)。

地西泮(1 mg/mL, CAS号:439-14-5)购自美国Sigma-Aldrich公司。乙腈(色谱纯,美国Merck公司);甲酸(色谱纯,美国Fisher Scientific公司),β-葡萄糖醛酸苷酶(活度>100 000 U/mL,上海安谱有限公司);乙酸、乙酸钠、氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 标准溶液的配制

移取地西泮标准物质1.00 mL,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释并定容至刻度,配制质量浓度为100 μg/mL 的标准储备液,于4 ℃避光保存。移取适量标准储备液,用乙腈逐级稀释,配制成质量浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和10 ng/mL 的标准工作溶液,现用现配。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

直接提取:准确称取均质后的试样2.0 g(精确至0.01 g),置于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋混匀30 s后,超声提取15 min,以 8 000 r/min 离心5 min,上清液待净化。

酶解提取:准确称取均质后的试样2.0 g(精确至0.01 g),置于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙酸钠缓冲溶液(0.2 mol/L,用乙酸调节pH值至5.2),涡旋混匀30 s后,加入β-葡萄糖醛酸苷酶50 μL,涡旋混匀,于37 ℃酶解过夜,然后取出冷却至室温,加入10 mL乙腈,涡旋混匀30 s后,超声提取15 min,以 8 000 r/min 离心5 min,取上层清液待净化。

1.3.2 净化

Prime HLB固相萃取净化:取待净化液3 mL,注入Prime HLB固相萃取柱,调节流速1滴/s,使样品溶液缓慢通过固相萃取柱,同时收集样品净化液于15 mL刻度离心管中,抽至近干后,滤液经0.22 μm滤膜过滤,待进样分析。

QuEChERS净化:将待净化液加入QuEChERS净化管中,高速涡旋1 min,以 8 000 r/min 离心5 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤,待进样分析。

1.4 分析条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱:Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温:35 ℃;流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流动相B:甲醇;流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 40%B; 1.0～6.0 min, 40%B～90%B; 6.0～8.0 min, 90%B; 8.0～8.1 min, 90%B～40%B; 8.1～10.0 min, 40%B。进样量:3 μL。

1.4.2 质谱条件

离子源:ESI源,正离子模式;检测方式:多反应监测(MRM)模式;电喷雾电压:5.0 kV;脱溶剂气温度:450 ℃;气帘气压力:241 kPa;雾化气压力:345 kPa;辅助雾化气:275 kPa;碰撞气压力:55 kPa。地西泮的监测离子对、去簇电压(DP)及碰撞能量见表1。

表 1 地西泮的母离子、子离子及其他质谱参数Table 1 Precursor ion, daughter ion and other MS parameters of diazepam

*Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱条件

将1 μg/mL 地西泮标准溶液以流动注射方式注入质谱仪,在正离子模式下进行一级质谱全扫描,确定其分子离子峰;以地西泮分子离子峰为母离子,对获得的母离子进行二级质谱扫描,确定目标物的主要离子碎片,选择相对丰度强、干扰小的离子对,通过优化碰撞能,确定最佳质谱条件(见表1)。

图 2 地西泮标准溶液(1 ng/mL)的提取离子流色谱图Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of diazepam in the standard solution (1 ng/mL)

2.1.2 流动相条件

地西泮分子结构中含有两个苯环和一个七元杂环(见图1),在C18色谱柱上保留较强。因此,色谱洗脱过程中,极易与基质中非极性组分共流出,导致色谱峰形较差或干扰严重。选择适宜的流动相能很大程度上降低基质干扰,提高方法的准确性。本实验考察了甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液分别作为流动相时,目标物与杂质的分离情况。经比较,采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相时可获得理想的色谱峰形和保留行为,且能与基质中干扰组分有效地分离,提高了方法的灵敏度,更适合于低含量水平地西泮的定性定量分析。地西泮标准溶液(1 ng/mL)的提取离子流色谱图见图2。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取方式的选择

为充分提取基质中的目标化合物,本文首先以地西泮阳性样品为例,比较了直接提取与酶解处理两种前处理方式对测量结果的影响。结果显示,经过酶解处理后,目标物测得的平均值为1.17 μg/kg(n=6),而未经酶解样品的测定平均值为1.25 μg/kg(n=6),略高于经酶解处理的样品;其次以空白加标样品为例,比较是否酶解对目标化合物回收率的影响(见表2)。结果显示,水产品经酶解处理后,地西泮回收率低于直接提取过程。可能是由于酶解后,基质中小分子化合物增多,目标物基质抑制作用增强,造成实测浓度降低。以上研究表明,水产品基质中，地西泮以游离形式存在，测定时无需进行酶解处理。

表 2 采用不同提取方式时地西泮的回收率(n=6)Table 2 Recoveries of diazepam using different extraction methods (n=6)

图 3 不同提取剂对地西泮回收率的影响Fig. 3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of diazepamSolvent 1: acetonitrile; solvent 2: acetonitrile (containing 1% (v/v) acetic acid); solvent 3: acetonitrile (containing 1% (v/v) ammonium hydroxide); solvent 4: ethyl acetate.

2.2.2 样品提取剂的选择

地西泮溶于乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂。实验以黄花鱼和明虾样品为例,比较了乙腈[2]、1%(v/v)乙酸乙腈[7]、1%(v/v)氨水乙腈[13]和乙酸乙酯[25]4种提取剂的提取效率(见图3)。实验发现,以乙酸乙酯为提取剂,样品提取溶液较浑浊,乳化现象严重,导致回收率低;采用1%乙酸乙腈和1%氨水乙腈为提取剂时的提取效率与纯乙腈的提取效率均在85%以上,无明显差异。综合考虑,本方法选择乙腈作为提取剂。

2.2.3 净化方式的选择

选取空白水产品样品,加入一定浓度的地西泮标准物质,经乙腈提取后,上机分析,计算目标物的回收率为155% ～188% ,呈现较强的基质增强效应,因此必须采取合理的净化方式,以降低基质效应(ME)的影响。本研究采用通过式固相萃取柱(Prime HLB),仅需样液上柱,无需活化、淋洗、洗脱等步骤,操作更快捷方便,且Prime HLB固相萃取柱填料因键合特有亲脂基团,能有效吸附水产品基质中的磷脂、脂肪、蛋白质等干扰物,从而实现样品净化目的。

为验证方法优越性,以不同水产品为研究对象,将采用Prime HLB柱(6 mg/3 mL)的净化方式与QuEChERS净化方式的净化效果进行了比较,以基质效应的大小进行表征。其中,基质效应的计算公式为ME=(基质匹配标准溶液曲线斜率/无基质标准溶液曲线斜率-1)×100% 。ME绝对值越大表明基质效应越强[23]。结果显示,经Prime HLB柱净化后,地西泮的基质效应明显低于QuEChERS净化(见表3)。

表 3 采用不同净化方式时地西泮的基质效应Table 3 Matrix effects of diazepam using different purification methods

2.2.4 不同规格SPE的选择

为获得最佳的回收率与净化效果,比较了两种规格(60 mg/3 mL和200 mg/6 mL)的净化柱对不同水产品的净化情况。结果如图4所示,当上样体积为3 mL时,采用含60 mg填料的净化柱,地西泮的回收率要优于含200 mg填料的净化柱。可能是由于含200 mg填料的固相萃取柱对地西泮有部分吸附;当上样体积增大至5 mL,采用含200 mg填料净化柱的回收率明显提高。综合考虑回收率、实验成本、检测效率等因素,最终选择填料为60 mg规格的Prime HLB固相萃取柱进行净化,上样体积为3 mL。

图 4 不同规格净化柱对地西泮回收率的影响Fig. 4 Effect of purification columns with different specifications on the recoveries of diazepam

2.2.5 SPE上样溶液的选择

Prime HLB固相萃取柱为通量型固相萃取柱,实际应用时多采用乙腈-水[26-28]作为上样溶剂。本研究选取不同体积分数的乙腈水溶液为试剂空白,并分别加入1.0 μg/mL 的地西泮标准溶液50 μL,并以此为研究对象,考察上样溶液中乙腈的体积分数对地西泮回收率的影响。如图5所示,随着乙腈体积分数的增大,目标物的回收率逐渐升高,当采用纯乙腈上样时,目标物的回收率接近100% 。因此本研究样品提取液无需用水稀释,可直接上样。

图 5 上样溶液中乙腈的体积分数对地西泮回收率的影响Fig. 5 Effect of volume fractions of acetonitrile on the recoveries of diazepam in sample loading solutions

图 6 氮吹对不同样品中目标物回收率的影响(n=3)Fig. 6 Effect of the nitrogen blowing on the recoveries of the different samples (n=3)

2.2.6 浓缩过程的考察

氮吹浓缩是兽残分析过程中常用的浓缩方式,经过浓缩,大部分分析物的灵敏度得到提高,对于痕量残留分析测定,浓缩步骤更是不可或缺。本研究分别以地西泮标准溶液、空白加标样品及地西泮阳性样品为例,考察氮吹浓缩前后地西泮响应值的变化情况。由图6可以看出,经氮吹后,目标物响应值均有不同程度的降低。其中,标准溶液中目标物响应降低的最多,损失约为70% ;空白加标样品及地西泮阳性样品中目标物响应降低程度为30% ～45% 。

为进一步确定氮吹浓缩过程目标物损失的原因,实验以标准溶液(5 ng/mL)氮吹为例,考察了加热温度(30、40和50 ℃)对目标物的影响。结果发现,经不同温度氮吹后,目标物的响应值无明显差异。因此,温度不是影响回收率降低的原因,可能的原因是氮吹过程目标物发生了变化或损失。兼顾方法的灵敏度与准确性,本方法不采用氮吹富集。

2.3 基质效应

采用2.2.3节描述对基质效应进行评价,以海水鱼、淡水鱼、海水虾等不同水产品为研究对象,评价不同样品的基质效应,结果见表3。由表3可见,不同鱼之间基质效应为3.9% ～7.6% ,不同虾之间基质效应为5.5% ～10.1% ,各水产品间基质效应差异不大,可采用外标法定量。为避免不同水产品含水量对测试样本最终体积的影响,本研究采用基质匹配标准曲线外标法进行定量分析。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系和检出限

称取一定量的空白基质,加入一定体积的标准工作液,按1.3节最优的前处理条件进行提取、净化,制备质量浓度依次为0.1、0.5、1.0、2.5、5和10 ng/mL 的基质标准工作溶液,按浓度由低到高进行测定。以目标物峰面积为纵坐标(Y),对应的质量浓度值为横坐标(X, ng/mL),绘制标准曲线,其线性方程及相关系数(r2)见表4。可以看出,对于不同水产品基质,在0.1～10 ng/mL 浓度范围内,均能呈现良好的线性关系,其相关系数均大于0.99。以3倍和10倍信噪比确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ),分别为0.5 μg/kg 和1.5 μg/kg。

表 4 地西泮的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients(r2), LODs and LOQs of diazepam

Y: peak area;X: mass concentration, ng/mL.

2.4.2 回收率与精密度

选取空白黄花鱼和虾样品,分别加入一定体积的地西泮标准溶液,添加含量依次为1.5、3.0和15.0 μg/kg,每个水平平行测定6次,计算添加回收率及方法日内精密度;按相同的样品处理方式,连续测定6 d,计算6 d内每个水平测得值的相对标准偏差,作为方法的日间精密度。结果如表5所示,3个水平下,地西泮的加标回收率为88.2% ～101.1% ,日内及日间精密度均小于10% 。表明该方法准确度高,重复性好,可满足水产品中地西泮残留定量的检测需求。

表 5 水产品中地西泮的回收率及精密度(n=6)Table 5 Recoveries and precisions of diazepam in aquatic products (n=6)

2.5 实际样品测定

应用所建立的方法对市售100批次水产品样品进行检测,有3批次黑鱼样品检出地西泮,检出值为1.7～4.0 μg/kg, 1批次鲤鱼样品检出,检出值为8.9 μg/kg,海水虾等其他样品未检出地西泮。

3 结论

本文建立了通过式固相萃取净化-液相色谱-串联质谱检测水产品中地西泮残留量的分析方法,并对提取溶剂、净化条件、浓缩方式、基质效应等关键因素进行了考察与评价。该方法前处理简便、经济、高效,且实用性强,可满足大批量样品的快速测定。本方法的建立可为水产品中地西泮的测定提供一种新选择,为水产品中地西泮检测标准的修订提供技术参考,同时为检验机构日常检测及政府质量监管提供技术保障。