肾透明细胞癌中X染色体生殖同源盆基因F1(Rhox F1)表达及其甲基化状态研究

程 欢，赵 浩，吴建强，李 望，王军起 (徐州医科大学附属医院泌尿外科，江苏 徐州 221000)

叶酸是人体内主要的甲基基团供体，亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢途径的关键酶之一，其催化作用决定了DNA甲基化与DNA合成之间的平衡。MTHFR基因呈多态性，其中以位于催化区的677(C→T)转换最为常见[1]，此种基因转换通过破坏总基因DNA甲基化、DNA合成与修复障碍而发挥致癌作用[2]。近年来有研究发现同源异型域转录因子在正常个体发育过程中发挥非常重要的作用，但一些同源异型域转录蛋白参与肿瘤的始动和转移过程[3]，如X染色体生殖同源盒基因家族(reproductive homeobox on X-chromosome，Rhox)。研究发现DNA甲基化使Rhox家族种系特异性基因处于沉默状态保证了正常的大鼠胚胎形成[4]。而人类的X染色体生殖同源盒基因F1(Rhox F1)在肿瘤细胞株中表达异常增高，而在正常组织如睾丸中该基因则处于不表达状态[5]。因此，本研究分析在肾癌中MTHFR基因多态性对Rhox F1的甲基化状态及其mRNA表达的影响，以期进一步阐明肾癌发生、发展的分子机制。

1 资料与方法

1.1材料：收集2010年3月～2010年9月徐州医科大学附属医院泌尿外科手术切除且均经病理证实为透明细胞癌的新鲜肾癌组织38例，并取相应的癌旁正常肾脏组织标本作为正常对照组，切除后立即置液氮冻存，所有患者术前均未接受过放化疗,均有详细的临床资料和手术记录，此项研究已通过徐州医科大学附属医院伦理委员会同意并取得受试对象的知情同意。

1.2方法

1.2.1Rhox F1基因的表达情况： 按总RNA提取试剂盒(Trizol)的操作说明分别提取不同来源组织的RNA。在提取的总RNA中取10 μg按反转录试剂盒说明以50 μl体系反转录成cDNA，实时PCR采用定量PCR中的相对定量法，以GAPDH作为内参照，同时以外周正常组织为基准，癌区组织RNA的SFRP 1基因(x)表达量均表达成外周正常组织的N倍(即Nx)。用于PCR扩增的SFRP 1特异性引物序列为正向：5′-GTGCGGGTTTGGTTTAAGAA-3′，反向：5′-CCAGAAAAACCCATCTCCAA-3′；内参照GAPDH引物序列为正向：5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′，反向：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′。每次定量反应后产物都经30 g/L琼脂糖电泳证明为所需扩增的片段。通常情况下，正常组织Nx位于0.3～3.0之间，Nx≥3.0为阳性表达，而<0.3为阴性表达。反应条件94℃ 5 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，每次反应均设3复孔，CT值取其均值。Nx=2-△△Ct。△△Ct=△Ct样品-△Ct基准=(Ct样品x﹣Ct样品GAPDH)-(Ct基准x-Ct基准GAPDH)。内参基因序列为TTTTAGGTGTGAAGAGGTGAGTTAGA。

1.2.2Rhox F1基因启动子甲基化分析：符合后续实验要求样本DNA中取5～12 μl，按EZ DNA Methylation Gold Kit甲基化修饰试剂盒(美国ZYMO公司)说明书进行甲基化修饰，修饰完成并纯化的DNA经10 μl的M-Elution Buffer洗脱后立即进行分析。甲基化特异性PCR(MSP)引物序列正向：5′-GTGAAGTGGTTTTAGTGTTTATATT-3′，反向：5′-CTCAAAAACTACCCTCCACC-3′。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃再延伸5 min。PCR产物采用20 g/L琼脂糖电泳，生物电泳图像系统分析结果。

1.2.3MTHFR基因型检测： 将MTHFR PCR扩增产物理想的样品进行限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术分析。限制性核酸内切酶Hinf Ⅰ特异识别GAGTC酶切位点，当677位点C→T颠换后，会产生1个Hinf Ⅰ酶切位点取PCR扩增产物，PCR反应体系为25 μl，10×Buffer 2.5 μl，引物终浓度0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，模板2 μl。扩增条件为：95℃预变性5 min，然后进行35个循环(每个循环包括94℃ 1 min，60.5℃ 1 min，72℃ 1 min)，最后72 ℃延伸8 min。选用PCR扩增产物测序确定是MTHFR 677位基因阳性的肾癌标本作为阳性对照，以高压双蒸水代替DNA模板作为空白对照。PCR产物由上海基康生物技术公司纯化并测序。每个酶切体系的体积为20 μl，上述反应体系置于37 ℃水浴5～8 h酶切消化，取酶切产物5 μl，20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图像分析仪观察结果。

1.3统计学处理：采用SAS 6.12统计软件包进行统计处理。计数资料用率(%)表示，两样本率比较用χ2检验或Fisher确切概率法。通过方差检验比较肾癌组织TT、CT和CC基因型mRNA的表达，再通过Dunnett-t法进行两两比较。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Rhox F1 mRNA的表达：正常组织中，14例Rhox F1基因mRNA阳性表达(36.8%)；肾癌组中34例Rhox F1基因mRNA阳性表达(89.5%)。两组间Rhox F1的mRNA阳性表达差异有统计学意义(χ2=22.619；P<0.001)。Rhox F1 mRNA的表达情况见图1。

2.2Rhox F1启动子甲基化状态分析：在正常组，30例Rhox F1启动子甲基化呈阳性；在肾癌组仅有7例甲基化阳性，正常组织中Rhox F1启动子CpG岛甲基化率(78.9%)显著高于肾癌组织(18.4%)，差异有统计学意义(χ2=27.861，P<0.001)。见图2。

注：Rhox F1为X染色体生殖同源盒基因F1；T为肾癌组织；N为正常组织

注：Rhox F1为X染色体生殖同源盒基因F1；M为甲基化；U为去甲基化

2.3肾癌中Rhox F1启动子甲基化率与其mRNA表达的关系：34例表达Rhox F1 mRNA的癌组织中有30例发生去甲基化，发生率高达88.2%(30/34)，在4例Rhox F1 mRNA表达缺失的癌组织中1例发生去甲基化，发生率为25.0%(1/4)。Rhox F1 mRNA阳性患者的Rhox F1启动子较Rhox F1 mRNA阴性患者去甲基化率高，差异有统计学意义(P=0.015)。表明Rhox F1 mRNA阳性表达患者，其启动子更容易去甲基化。

2.4MTHFR 677(C→T)基因多态性：34例Rhox F1 mRNA 阳性表达的肾癌组织[MTHFR 677(C→T)]中TT基因型患者25例，CT基因型5例，CC基因型4例。TT、CT、CC基因Rhox F1 mRNA表达水平差异具有统计学意义(F=80.201，P<0.001)，其中TT基因Rhox F1 mRNA表达水平(0.91±0.01)显著高于CT基因型(0.33±0.03)和CC基因型(0.26±0.03)，差异均有统计学意义(均P<0.001)；CT与CC基因型组间Rhox F1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。TT基因型中有24例Rhox F1启动子去甲基化(96.0%)，CT基因型有2例(40.0%)，CC基因型有1例(25.0%)。TT、CT、CC三组基因Rhox F1启动子去甲基化率差异具有统计学意义(P<0.001)，其中TT基因Rhox F1启动子去甲基化率显著高于CT基因型和CC基因型(P=0.009，P=0.004)。CT与CC基因型组间Rhox F1启动子去甲基化率差异无统计学意义(P=0.595)。

注：MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶；CC、CT、TT为基因型

3 讨论

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展涉及众多原癌基因和抑癌基因的协同作用。近年来的研究结果显示，DNA甲基化广泛存在于各种恶性肿瘤，包括泌尿系统肿瘤[6]。在对大鼠的研究中，Rhox家族中超过30种功能性基因已被证实，其中大多数集中于Rhox 5[7]，最新研究表明异常的Rhox 5表达可干扰神经生长因子-1受体基因Unc5c的转录[8]，而Unc5c在结肠癌的发病过程中扮演着抑癌基因的角色[9]。由于Rhox家族基因存在同源性，可见其他功能性基因可能存在着与Rhox 5相同或者相似的生物学致癌作用，其表达水平的调节机制显得尤为重要。尽管如此，目前对主要存在于人类中的Rhox家族成员Rhox F1、Rhox F2和Rhox F2B的研究甚少，它们在人类癌症中的表达水平及其甲基化是否参与调节机制尚不明了。本研究结果显示，在肾透明细胞癌组织中Rhox F1 mRNA表达水平明显高于正常组织，癌组织中Rhox F1启动子去甲基化率明显高于正常组织，二者关系分析提示Rhox F1 mRNA表达水平异常增高可能是肾透明细胞癌发生与进展的机制之一，而Rhox F1 mRNA高水平表达可能是通过其启动子区域去甲基化来实现的。

在甲基化过程中，叶酸是主要的甲基基团供体，叶酸缺乏或代谢障碍与许多肿瘤的发病风险增高相关[10]。而MTHFR C677T能够不可逆地催化5,10-亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸，它通过合成S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)而参与多种甲基化过程，可使变异体酶对热不稳定且活性显著降低，影响酶的活性，TT纯合基因型的酶活性仅为CC野生型的30%[11]，而酶活性的降低改变了SAM水平，从而导致DNA去甲基化或低甲基化，增加了染色体的不稳定性。目前已有研究发现叶酸摄入和MTHFR基因多态性与部分肿瘤相关基因甲基化紊乱有关。本研究结果显示肾癌组织中携带677 TT的患者Rhox F1启动子去甲基化率和mRNA表达明显高于CT和CC基因型，可能机制为MTHFR 677 TT基因型个体中MTHFR的酶活性较其他两种基因型低，减少了同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转变，使SAM水平异常下降，导致了Rhox F1启动子区域去甲基化，异常激活Rhox F1过量表达，干扰抑癌基因的转录，打破了某些原癌基因与抑癌基因的平衡关系，最终导致肿瘤的发生。

肾癌的发生及发展是一个多阶段的复杂病变过程，位点特异的DNA甲基化调控基因的表达极其重要[12]。由于去甲基化异常激活及表达，影响了某些抑癌基因的转录合成，直接导致肾癌的发生；而叶酸代谢酶MTHFR 677 TT多态性可影响Rhox F1启动子的甲基化和核酸的稳定性，从而间接参与肿瘤的形成[13]。但由于样本数量有限，本研究未能进一步探究其余两种Rhox基因与MTHFR多态性的关系，但从这次实验中可看出一定趋势，即MTHFR多态性通过影响部分Rhox基因启动子区域甲基化状态而调控其表达。因此，大样本的实验有待开展，进一步验证本研究结果，深入了解肾癌发生、发展的分子机制，可为个体化的临床辅助诊断、病程监控和治疗提供新的理论参考依据。