补充维生素E 和硒对围产期奶牛分娩应激和繁殖性能的影响

2020-05-22柳巨雄

中国畜牧杂志 2020年5期

陈庞，柳巨雄

（吉林大学动物医学学院，吉林长春 130012）

孕期、非哺乳期到非孕期、哺乳期阶段奶牛产后应激是产后繁殖能力下降的主要原因之一。围产期奶牛易患营养代谢性疾病、免疫功能下降和生殖性疾病。围产期奶牛生殖器官以及机体内组织的细胞代谢显著增加，导致产生超出细胞抗氧化能力的氧化自由基（ROS）[1]。维生素E 和硒（Se）是有效的抗氧化剂和自由基清除剂。补充抗氧化剂可补偿自由基负荷，增加中性粒细胞活性，促进子宫收缩、子宫复旧，降低胎膜滞留的发生率[2]。此外，补充抗氧化剂还提高了牛的受精率和绵羊的胚胎存活率。在妊娠晚期和哺乳早期，奶牛机体由于分娩导致其处于长期的应激状态，导致奶牛采食量下降，导致奶牛进入能量负平衡阶段，从中恢复可能需要几周时间。围产期的营养调控则通过体营养轴提高奶牛的繁殖性能[3]。当奶牛处于能量正平衡时卵泡内促进卵泡发育的胰岛素样生长因子1（IGF-1）以及血浆孕酮水平出现升高，并且能量正平衡可提升奶牛卵母细胞的质量[4]。提高日粮中精料比例可改善胚胎发育[5]、胚胎孵化、胚胎伸长和干扰素的表达[6]。因此推测可以通过改善奶牛产后及分娩应激来提升奶牛采食量，缓解奶牛分娩后出现能量负平衡状态，从而提高奶牛的繁殖能力。本试验旨在研究围产期饲料中补充维生素E 和硒对奶牛氧化应激、免疫细胞功能和产后繁殖性能的影响，为奶牛抗氧化应激及提高奶牛繁殖能力等相关研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计及日粮试验随机选取吉林省某集约化牛场（3.67±0.28）岁、（1.67±0.13）胎、体况（4.0±0.5）分和泌乳量（31.54±2.71）kg/d 健康的26 头产后荷斯坦牛。试验奶牛分为试验组和对照组（n=13）。试验组和对照组平均体重分别为（418.0±21.65）、（406.5±14.20）kg，通过独立样本t 检验显示2 组奶牛体重之间无显著差异。试验组在产后干物质基础上添加80 IU/kg 维生素E（dl-α-生育酚乙酸酯）和0.3 mg/kg 硒（亚硒酸钠）[7]。奶牛日粮组成及营养成分见表1。

表1 围产期奶牛日粮组成及营养成分

1.2 血液样本采集在产前4 周至产后8 周阶段，每周用10 mL 注射器通过尾静脉穿刺采集试验动物的血样。肝素化的真空吸收器用于分离外周血单个核细胞（PBMC）和粒细胞。3 000 r/min 离心10 min，分离血清，保存于-80℃。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 氧化应激指标利用南京建成公司生产的试剂盒进行双加热法测定血清丙二醛（MDA）含量。利用生物流体在芬顿反应产生的自由基影响下抑制苯甲酸钠生成硫代巴比妥酸反应物质（TBARs）的能力检测血清总抗氧化力（TAC）含量。血清超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）采用南京建成公司生产的试剂盒利用分光光度计进行检测。

1.3.2 免疫功能吞噬细胞（PA）活性和淋巴细胞（LPA）增殖试验根据Hallett 等[8]的研究方法进行。

1.3.3 生殖性能记录产后第1 次发情时间，并采用冷冻精液对2 组产后发情奶牛进行输精。输精后经直肠检查，记录妊娠率等生殖变量。

1.4 统计分析使用SPSS 19.0 软件（IBM®SPSS®Statistics）进行统计分析。检测数据是否符合正态分布（P＞0.05）。采用GLM 重复测量方差分析法分析氧化应激和免疫变量的数据。采用Kaplan-Meier 生存率分析从产犊到产后第1 次发情的时间间隔。采用对数秩检验确定2 组产后第1 次发情间隔的统计差异。采用Fisher 精确检验法研究添加剂对妊娠率的影响。变量表示为平均值±标准误。显著性标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 维生素E 和硒对围产期奶牛氧化应激指标的影响由图1 可知，在产犊前4 周，对照和试验组奶牛血清中4 种氧化应激指标均无显著性差异，分娩当天4 种指标均有差异。试验组产后第1 周血清中MDA 含量显著低于产后第8 周。产犊前4 周至分娩当天2 组血清TAC 含量均急剧下降，试验组产后1、2、3、6、7 周TAC 含量显著高于对照组。产后第1、2、6、7、8 周2 组血清中SOD 活性差异显著，2 组奶牛在分娩当天时血清中SOD含量达到最高浓度。2 组奶牛产后第1 周和第4 周血清中CAT 含量显著下降。在产后早期奶牛血清中MDA 浓度较高和TAC 水平较低，表明此时氧化应激相对较高。

2.2 维生素E 和硒对围产期奶牛血清中免疫水平的影响由图2-A 可知，2 组PA 在产前4 周至产前2 周无显著差异；产前1 周、分娩当天、产后3～8 周时，试验组PA 显著升高。由图2-B 可知，试验组分娩当天、产后4 周和8 周血清中LPA 均显著高于对照组（P＜0.05）。

图1 2 组奶牛牛血清中MDA、TAC、SOD 和CAT 含量

2.3 维生素E 和硒对围产期奶牛繁殖性能的影响如表1 所示，试验组产后第1 次发情的平均间隔时间比对照组短13 d。与对照组相比，试验组的妊娠率增加了49.8%。对数秩检验显示产后发情恢复具有统计学意义（χ2df1=20.03，P＜0.05）。从K-M 存活曲线来看，试验组46.15%的奶牛在30 d 内恢复发情，而对照组0%（图3）。与对照组相比，试验组奶牛的妊娠率高23.40 倍（95%CI：1.15～475.9）。

图2 2 组奶牛血清PA（A）和LPA(B)含量

表2 维生素E 和硒的补充对奶牛繁殖性能的影响（n=13）

图3 Kaplan-Meier 生存分析曲线

3 讨论

在临床生产中，牛场会通过调整精粗比来平衡奶牛产后出现的能量负平衡，大量的精饲料导致机体内自由基生成增加，还会引起奶牛瘤胃酸中毒[9]，由此可见直接添加精饲料对缓解奶牛能量负平衡存在着弊端。有研究显示，维生素E 及硒可以结合体内自由基，并有效缓解产后应激反应，提升奶牛采食量[10]。本试验提出假设，产后在奶牛饲料中补充维生素E 和硒将会抵消部分氧化应激代谢的负面影响。奶牛体内一些代谢产物可反映机体的氧化应激程度[11]，如MDA 是脂质过氧化的重要指标，TAC 是抗氧化的指标。本次试验结果表明，试验组奶牛血清中MDA 含量在分娩后第2 周和第4 周分别达到峰值，并在分娩前4 周逐渐升高，这与Chandra 等[12]的研究结果一致，即补充维生素E 和锌后奶牛血浆中TBAR 从产犊前60 d 开始增加，在产后15 d 和30 d 达到最大值。Adela 等[6]研究显示[13]，产犊前1 周机体MDA 含量逐渐升高，产后第1 周较哺乳后期显著升高。产犊后MDA 含量的升高表明奶牛处于氧化应激状态。本试验结果显示，奶牛TAC 随产期临近呈下降趋势，随着产后时间的延长TAC 含量逐渐上升，表明试验牛产犊前后存在明显的氧化应激。与Brezezinska 等[14]的结果一致。由于产犊过程导致机体出现应激反应，体内的自由基升高，降低了SOD 和CAT 浓度，导致TAC整体降低[15]；而由于产后泌乳量提升的需要，机体代谢率急剧上升，TAC 含量也逐渐上升。Chatterjee 等[16]试验结果显示，奶牛机体TAC 含量在分娩时最低，奶牛产后补充维生素E 可显著改善TAC 含量。围产期奶牛血浆α-生育酚和TAC 含量呈正相关（r=0.63）[17]，这与本次试验中添加维生素E 的试验组奶牛TAC 含量升高结果一致。本次试验结果中Kaplan-Meier 生存分析曲线展示补充维生素E 和硒后未发情牛比例下降，且试验组及对照组之间受胎率出现差异性的变化。氧化应激指标（SOD、CAT、TAC）以及受胎率、发情率的变化表明，围产期日粮中补充维生素E 和硒不仅有利于奶牛提高繁殖能力，而且有利于减少氧化应激。

Chandra 等[18]的试验结果表明，在奶牛产犊前3 周内，自由基水平的增加导致SOD 活性增加，补充维生素E 和锌后奶牛的自由基水平逐渐下降直至产后60 d。Bernaucci 等[19]也得到了类似的结果。根据现阶段的研究结果，无法解释产后4 周SOD 活性上升原因。机体内SOD 活性可以增加H2O2的生成，而CAT 和其他抗氧化物活性增加可以保护机体免受活性氧（H2O2等）的侵害，因此，CAT 和SOD 活性之间存在着相关性。本试验结果表明，2 组的CAT 活性在产犊期增加，试验组CAT 活性低于对照组，表明试验补充维生素E 和硒可有效增强抗氧化应激能力。

本研究结果表明维生素E 和硒对吞噬作用具有积极影响。Boxer 等[20]认为，最佳浓度的硒对吞噬作用至关重要；而Grasso 等[21]试验结果表明硒对中性粒细胞的吞噬能力没有影响。据报道维生素E 的补充可以增强吞噬作用[23]。Hogan 等[22]研究显示，产犊前1 周以及产犊前期吞噬细胞活性显著增加。本试验结果与此类似，从产犊到产后3 周，试验奶牛的PA 更高。本研究结果显示，产后第1 周粒细胞PA 下降，第3～8 周粒细胞PA呈极显著上升。中性粒细胞的吞噬作用导致细胞内呼吸急促，这对杀死被吞噬的抗原至关重要[23]。在这个过程中，氧化应激很可能是由于吞噬细胞中自由基的泄漏而产生，而补充维生素E 和硒可以缓解这种情况[24]。本研究结果表明，补充维生素E 和硒增加了产犊时淋巴细胞的刺激指数。Mavi 等[25]研究显示，饲料中添加维生素E 能提高仔猪对白蛋白A 刺激的淋巴细胞反应，产犊前后外周血淋巴细胞有丝分裂反应显著降低，淋巴母细胞反应相对较低[26]。奶牛分娩过程中高水平的炎性介质（如前列腺素、炎性细胞因子、糖皮质激素等激素）增加，呈现免疫抑制疾病。产犊当天的LPA 和PA 显著升高可能是由于产犊的最后1 周，是由于试验组补充维生素E和硒导致糖皮质醇水平下降，糖皮质下降后LPA 和PA水平会有所增加[27]。

多数研究显示补充维生素E 和硒对产后奶牛生殖性能的影响是可变的，在本研究中试验组奶牛首次发情和怀孕率显著改善。在高产奶牛中常见因分娩和泌乳应激导致机体采食量下降，奶牛出现能量负平衡状态，会使奶牛容易产生乏情、子宫感染和受精失败，从而损害奶牛的繁殖性能。有研究显示，日粮中补充维生素E 和硒可以改善高产奶牛产后应激，从而缓解能量负平衡状态[28]，缓解能量负平衡状态后将会缩短奶牛子宫复旧时间，促进卵泡的发育，提升繁殖效率。本试验结果亦显示，妊娠晚期补充维生素E 和硒可以提高奶牛的繁殖能力。然而补充维生素E 和硒对产后生殖性能的影响原因尚不清楚，需进一步研究分析。