中药复方制剂对雏鸡生产性能、肠道结构及微生物菌群的影响

李姣清，赖美辰，翁茁先,2，钟 鸣，李威娜，刘春燕，刘梦林，唐 玲，陈燕珊，吴文超，黄勋和*

（1.广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东省五华三黄鸡科技创新中心，嘉应学院生命科学学院，广东梅州 514015；2.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；3.梅州市水木雨有机农业专业合作社，广东梅州 514000）

育雏是整个养鸡生产中影响生产效益最关键的环节。在当前集约化养殖条件下，仔鸡在育雏阶段容易出现以炎症、消化功能紊乱、外来病原菌感染、微生物菌群失调和腹泻为主的育雏鸡应激综合征。如何防治育雏鸡应激综合征是现代养鸡业亟待解决的问题。饲料中添加抗生素可以促进禽类生长，提高仔鸡存活率，但抗生素具有药物残留和抗药性以及对环境的污染等危害，限制了其应用[1-4]。因此，抗生素的替代品成为研究重点。中草药是天然绿色植物，兼有营养和药用两种属性，不易产生抗药性，无药残，且具有健脾理气、增强机体免疫力、促进动物生长发育、提高饲料利用率等功能[5-7]。目前有关中草药添加剂在养鸡业中的研究主要集中在免疫调节功能方面，而在雏鸡肠道发育及菌群多样性建立方面的研究较少。本研究根据中兽医学辩证施治的理论，依据平补消导、健脾理气的组方原则组配方剂，探讨中药复方制剂对育雏阶段的三黄鸡生长发育、肠道黏膜形态结构、肠道菌群的影响，分析其促生长机理，为生产无抗生素高品质鸡饲料以及无抗生素残留的鸡肉产品、保护生态环境平衡提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 健康的1 日龄五华三黄鸡由广东客家黄畜牧有限公司提供。氟哌酸购于上海新城牧业科技有限公司。

中药复方制剂主要原料为生地、熟地、玄参、淫羊藿、黄芪、板蓝根、大蒜、生姜、马齿苋、苍术、苦参、山楂、麦芽等，购于梅州市中医院医院。加10 倍中药材重量的蒸馏水浸泡30 min，加热至沸腾后文火保持30 min，用6 层纱布过滤，药渣再加8倍量蒸馏水，加热至沸腾文火保持30 min，6 层纱布过滤，合并2 次滤液，滤液经80℃恒温水浴浓缩至原生药量1 g/ mL，115℃高压灭菌20 min，4℃保存备用。

1.2 试验设计和饲养管理 选取1 日龄健康、体重相近的五华三黄鸡母雏鸡120 只，随机分成3 组，每组4 个重复，每个重复10 只。对照组喂食基础日粮，抗生素组饲料中按氟哌酸使用说明添加0.4%，中药复方制剂组按1 g/kg 体重将中药复方汤剂添加到半天的饮水中[8]。仔鸡从第1 天开始在饲料中分别连续添加抗生素和中药复方制剂，试验期42 d。饲养方式为舍内笼养，自由采食和饮水。基础日粮组成参照我国肉鸡标准（2004）[9]配置，日粮组成及营养成分见表1。

表1 基础日粮组成及营养成分

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长性能 准确记录每天喂料量和剩余量，分别对1、21、42 日龄的试验雏鸡早晨进行空腹称重并统计饲料消耗，计算各重复的平均日采增重量、平均日采食量、耗料增重比。

平均日采增重量=全期增重（g）/天数（d）

平均日采食量=全期采食量（g）/天数（d）

耗料增重比=饲料消耗/增重

1.3.2 肠道形态结构 于试验第42 天，从各试验组每个重复中随机选取5 只体重接近均值的试验鸡进行屠宰试验。解剖后分离肠道，取盲肠内容物迅速放置液氮中并保存于-80℃冰箱中备用，另取空肠中段肠组织1 cm左右，用生理盐水冲洗干净后放入固定液中固定，经HE 染色，对绒毛高度和隐窝深度等黏膜形态学指标进行测定。

1.3.3 肠道微生物多样性 将鸡盲肠内容物样品（100±10）mg，用Omega D4015 粪便DNA 提取试剂盒购于上海生物工程有限公司，按操作手册要求提取总DNA，将DNA 样品送至广州基迪奥生物科技有限公司完成测序工作。采用Illumina Miseq 高通量测序技术对肉鸡盲肠微生物16S rRNA 基因的V3-V4 区进行测序，获得的序列通过Mothur 软件平台，剔除低质量的DNA序列之后，计算序列之间的距离。每一个运算分类单元OTU 代表序列相似度大于97% 的DNA 序列，用于试验各处理组的样品进行菌群多样性分析和聚类分析，并使用Sliva 和RPD 数据库对所有OTUs 的代表性序列进行物种匹配，对样品的各个细菌属组成进行统计，得到菌群分析结果。通过QIIME 软件计算Alpha 多样性指数Chao1、ACE、Shannon 来反映微生物物种的丰度度信息。

1.4 统计分析 通过Excel 整理数据后，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan´s 法对各组平均值进行多重比较。数据以平均值±标准误表示，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡生长性能的影响 与对照组相比，中药复方制剂组显著提高了雏鸡的平均日采食量和平均日增量，显著降低了雏鸡生长期的耗料增重比，试验期间鸡体重增重较对照组提高了21.3%（表2）。与抗生素添加组相比，中药复方制剂组雏鸡平均日增量和日采食量均显著增加，但耗料增重比差异不显著。

2.2 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡空肠黏膜结构的影响 中药复方制剂组的空肠绒毛高度、黏膜层厚度和绒毛高度/隐窝深度显著高于其他处理组（表3）。中药复方制剂组的隐窝深度较对照组显著降低，但抗生素组的隐窝深度较中药复方制剂组显著增加，且黏膜层厚度明显变薄。抗生素组的绒毛高度显著大于对照组。中药复方制剂组空肠绒毛高度较抗生素处理显著增加。

雏鸡饲料中添加中药复方制剂后，空肠的绒毛排列紧密且整齐，数量明显增多（图1）。

2.3 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡盲肠微生物群落的影响

2.3.1 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡肠道菌群的影响通过Alpha 多样性指数分析，各样品中有效序列覆盖度指数大于0.99，说明该测序结果基本已覆盖样本的多样性（表4）。通过Uparse 软件计算97% 相似水平上各样品的OUT 数量，中药复方制剂组中OUT 数量最多，数量达590，显著高于对照组。Alpha 多样性分析也显示，中药复方制剂组的ACE 指数、Shannon 指数均显著高于对照组和抗生素组，表明中药复方制剂组雏鸡盲肠微生物物种的丰富度和多样性更高。

对照组、抗生素组、中药复方制剂组特有的OTU数目分别是44、47、80 个，共有的OUT 数目为453 个，中药复方制剂组微生物物种多样性高于对照组（图2）。

2.3.2 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡肠道菌群在属水平结构上的分析 对雏鸡盲肠菌群中丰度最高的13 个属进行统计发现（图3），球菌属（Torques_group）、拟杆菌属（Bacteroidales）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）丰度最高，丰度值均高于10%；中药复方制剂添加处理的雏鸡盲肠微生物中Torques_group、粪杆菌属（Faecalibacterium）、乳杆菌属（Lactobacillales）、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae_UCG-005；Ruminococcaceae_UCG-014）的丰度值显著高于对照组和抗生素组，而肠杆菌属（Enterobacter）、拟杆菌属（Bacteroidales）、放线菌属（Actinomycetes）的丰度值较对照组相比下降显著。

2.4 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡盲肠主要优势菌群的分析 通过LEFse 分析各处理组间具有显著差异的物种丰度，LDA 评分直方图显示各组间具有统计学差异的生物标志（Biomarker），柱形图的长度代表LDA 评分。由图4 可知，对照组、抗生素组、中草药复方制剂组间丰度显著差异微生物类群（LDA Score 2.0），中药复方制剂组中丰度优势的菌群较对照组和抗生素组种类明显增多，其中含有具有丰度优势的菌群Teroidesthet_aiotaomicron、Lactobacillus_salivariushe、Bacillaceae等肠道有益菌。

表2 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡生长性能的影响

表3 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡空肠黏膜结构的影响

图1 雏鸡空肠绒毛形态（40×）

表4 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡肠道菌群的影响

图2 OTU venn chart 图

图3 属水平上的物种堆叠图

3 讨 论

图4 各组中主要的优势微生物菌群

3.1 日粮添加中药复方制剂对育雏期仔鸡生长性能的影响 日粮中添加中药可以提高动物食欲、增加动物营养、促进机体的消化吸收、提高动物生长性能[10-11]。祝国强等[12]研究发现，在艾维茵肉仔鸡词料中添加当归、黄柏等16 味中药显著提高了鸡的平均日增重，降低了耗料增重比。锡建中等[13]研究发现，在肉鸡饲料中添加黄芪、当归、大蒜、紫苏、小茴香、肉桂、牛膝能显著提高AA 肉鸡的采食量并降低耗料增重比。本试验结果表明，与对照组相比，日粮中添加中药复方制剂可显著提高鸡的日增重，降低耗料增重比。《景岳全书》中云：“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷”。本试验中遂在复方中添加生地、熟地、玄参等中药补气升阳，调补脾胃，以达于阴求阳之功效，同时中药成分板蓝根、马齿苋、苦参、玄参具清热解毒和抗菌，黄芪、苍术行气健脾，可在雏鸡母源抗体逐渐消失的育雏阶段保护机体免受外界疾病感染，使机体能集中将更多的营养物质用于雏鸡生长。另外，雏鸡在舍内笼养条件下极为贪吃，易造成胃内积食，消化不良。本试验中马齿苋、山楂等经过科学组合可以改善雏鸡的消化机能，增强食欲，使新陈代谢加快，促进营养吸收，从而促进其生长。

3.2 日粮中添加中药复方制剂对育雏期仔鸡肠道黏膜结构形态的影响 小肠尤其是空肠段作为动物营养成分吸收的主要场所，在营养物质消化吸收过程中发挥着重要作用。小肠绒毛作为营养物质吸收的主要部位，其高度的变化直接影响机体消化、吸收营养物质的能力。Caspay 等[14]报道，绒毛高度增加使小肠接触营养物质的面积增大，增强小肠对营养物质的吸收。隐窝细胞与绒毛上皮细胞的更新密切相关，其深度反映了隐窝细胞的增殖率和成熟度，隐窝变浅则分泌功能增强，绒毛上皮细胞再生能力强，有利于维持肠道强的吸收功能。绒毛高度/隐窝深度综合反映小肠的功能状况，其数值增大表明小肠消化、吸收功能增强[15-16]。本研究结果显示，中药复方制剂组雏鸡空肠的绒毛高度显著高于对照组和抗生素组，绒毛高度/隐窝深度也显著增加，空肠结构明显优于对照组和抗生素处理组。本研究中的中药复方制剂对小肠形态结构有积极影响，可有效地改善肠道健康和功能，促进雏鸡的生长。

3.3 日粮中添加中药复方制剂对雏鸡盲肠微生物群落的影响 雏鸡刚从蛋中孵化出来肠道是无菌状态，随着进食，肠道群落迅速建立起来，肠道正常微生物群落相对稳定的动态平衡对抵御外来病菌侵入、食物的消化和吸收有重要作用，是维持雏鸡机体健康的必要条件[17]。本研究中中药复方制剂组使雏鸡肠道菌群多样性指数ACE、Shannon 升高，多样性显著高于对照组。高多样性的肠道菌群对宿主的健康有着非常重要的作用[18]。本研究通过OUT 聚类丰度和LEFse 分析，结果显示中药复方制剂组菌群的差异显著大于对照组，尤其是乳杆菌的丰度比例大于1%，此菌是公认的肠道益生菌；teroides_thetaiotaomicron能阻止外源病原微生物的定殖，维持肠道菌群平衡，同时放线菌、肠杆菌和拟杆菌的丰度比例与对照组比均有下降，表明中药复方制剂可以改变雏鸡肠道菌群的结构和组成，有利于维持肠道微生态环境的健康和鸡的健康生长。

4 结 论

本试验结果表明，在日粮中添加中药复方制剂可显著提高三黄鸡的日增重和饲料利用率，还可以明显改善肠道的健康状况，饲喂效果有优于抗生素添加剂的趋势。