牛血清蛋白及大豆卵磷脂对山羊精子保存效果的影响

刘文江，何玉强，周多恩，刘德武，孙宝丽，李耀坤，郭勇庆，邓 铭，柳广斌

（华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

人工授精技术在绵羊繁殖中的应用多于山羊，主要是因为绵羊人工授精技术研发时间较长且技术成熟。山羊与绵羊的精子生理特性不同，山羊精清中由尿道球腺分泌的卵黄凝固酶和SBU Ⅲ分别会与绵羊用卵黄精液稀释液和乳汁稀释液发生毒害作用以及强烈抑制山羊精子活力的反应[1]，而且添加动物源性蛋白也将提高感染风险[2]，因此不能直接将绵羊人工授精技术用于山羊，从而制约了山羊规模化养殖发展与优秀山羊品种的培育。

稀释液可扩大精液配种量并短期保存精液，是影响山羊精子保存质量的关键所在[3]。调整精液稀释液配方能增强其营养、缓冲、抗菌、抗氧化和保护等作用。牛血清蛋白（BSA）是绝大多数哺乳动物精子的获能物质，可以阻止精子质膜粘连[4]。一定浓度BSA 能提高低温保存牛精子的生存能力[5]。已有使用大豆卵磷脂等非动物源性物质替代卵黄在稀释液中作为其他动物精子保护物质的研究报道[6]，但这些添加剂在山羊精液稀释液中的应用仍需优化。本研究拟利用BSA 及大豆卵磷脂从精子活力、质膜完整率、顶体完整率及保存时间等指标评价并改良现有基础精液稀释液常温保存山羊精液的效果，以期提供一种山羊常温精液稀释液，为提高山羊配种效率及人工授精技术在山羊养殖业中的应用推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取广东地区某种羊场健康且状况相似的成年川中黑山羊公羊5 头。

1.2 实验试剂 水葡萄糖购于广州化学试剂厂；果糖、柠檬酸钠、EDTA、碳酸氢钠、Hepes 均购于美国Sigma-Aldrich 公司；BSA 购于北京Solarbio 公司；大豆卵磷脂购于生工生物工程股份有限公司；青霉素、链霉素均购于圣旺药业股份有限公司；恩诺沙星、诺氟沙星均购于华源药业有限公司；庆大霉素购于大连兽药；卵黄在市场购买；精子快速染色试剂盒由南京建成公司生产。

1.3 精液采集、检测 利用假阴道法采集其精液后立即检测，确保精液颜色和气味正常，精子活力达到0.7 以上，密度在中等以上。检测合格后混合并按精液与精液稀释液1:4 的比例稀释山羊精液，并从稀释时刻起每隔12 h对精子的活力、精子质膜完整率、顶体完整率、存活时间及存活指数进行检测。检测方法均按GB 20557-2006标准执行[7]。将每份精液样品每次制备于3 个玻片用于各指标检测，每次实验重复3 次。

1.4 基础稀释液的筛选 参考文献[8-10]选择6 种精液稀释液配方作为候选基础配方，稀释液配方如表1 所示。从精子活力、有效存活时间、总存活时间以及生存指数比较6 种配方对山羊精子的保存效果，检测方法同1.3。筛选效果最佳的一种作为本研究的基础配方。

1.5 精液的稀释方法 试验组首先在基础稀释液中分别添加0、1、2、3、4 g/L BSA，筛选BSA 最适添加浓度。再以所得最适BSA 添加浓度为基础配制稀释液，各试验组分别添加0、1、2、3 g/L 大豆卵磷脂，筛选最佳大豆卵磷脂浓度。检测项均同1.4 并加上其对山羊精子质膜完整率和顶体完整率的影响，检测方法同1.3。

1.6 统计分析 使用WPS2019 软件对数据进行分组整理，数据的统计显著性检验使用IBM SPSS Statistics 25 软件中的单因素方差分析，P＜0.05 为差异显著，并采用Duncan´s 方法对各组间平均数进行多重比较，结果均以平均值± 标准误表示。数据的可视化处理使用GraphPad Prism 8 软件。

2 结果与分析

2.1 基础稀释液的筛选

2.1.1 精液稀释液成分的差异对山羊精子活力的影响由图1 可知，60 h 时，只有配方为E 和F 的精液稀释液中的精子仍然存活。最终结果显示E 配方稀释液中的精子活力下降最少且速度最慢。

2.1.2 不同配方的精液稀释液对山羊精子保存时间的影响 由图2 可知，E 配方稀释液组的有效存活时间、生存指数和总存活时间3 项指标都显著高于其他配方组。总体来看，采用E 配方的稀释液保存效果最优，因此选取E 配方作为用于后续实验的基础稀释液。

2.2 BSA 对山羊精液保存效果的影响

2.2.1 BSA 对山羊精子活力和保存时间的影响 由图3可知，添加不同浓度BSA 在0 h 开始就对精子存活产生了影响，添加BSA 可以提高精子的存活率（P＜0.05）。不添加BSA 和添加4 g/L BSA 组精液稀释液中的精子在72 h 时全部死亡，而其他浓度梯度BSA 组中的精子依然具有活力，其中3 g/LBSA 组在各时间点的精子活力均高于其他组。由图4 可得，稀释液添加3 g/LBSA 时，精子的有效存活时间、总存活时间和生存指数都高于其他组（P＜0.05）。

表1 初选稀释液配方

图1 精液稀释液成分的差异对山羊精子活力的影响

2.2.2 BSA 对山羊精子质膜完整率和顶体完整率的影响由图5 可得，不添加BSA 和添加4 g/L BSA 组精液中的精子质膜在72 h 时已经没有完整率，而其他浓度梯度BSA 组精液中的精子质膜依然具有完整率，其中3 g/L BSA 组在0 h 之后各时间点的精子活率均高于其他组，提高了山羊精子质膜的完整率（P＜0.05）。由图6 可知，0 h 时间点开始，添加不同浓度BSA 就对山羊精子顶体完整率产生了影响。1 g/L BSA 组精液稀释液中的精子在12 h 时顶体完整率最高；而在其他时间点，3 g/L BSA 组的精子顶体完整率均高于其他组。从整体来看，精液保存效果随着BSA 浓度地增加呈先升后降的趋势，其中以添加3 g/L BSA 效果最佳。

2.3 大豆卵磷脂对山羊精液保存效果的影响

2.3.1 大豆卵磷脂对山羊精子活力和保存时间的影响由图7 可得，从0 h 时间点起，添加不同浓度大豆卵磷脂即对精子的存活产生了影响。2、3 g/L 大豆卵磷脂组精液稀释液中的精子在72 h 时全部死亡，而其他实验组中的精子依然具有活率，其中1 g/L 大豆卵磷脂组在各时间点的精子活率均高于其他组。由图8 可知，1 g/L大豆卵磷脂组被稀释的精子的有效存活时间、总存活时间和生存指数均高于其他组（P＜0.05）。

图2 不同配方对山羊精子保存时间的影响

图3 BSA 对山羊精子活力的影响

图4 BSA 对山羊精子保存时间的影响

2.3.2 大豆卵磷脂对山羊精子质膜完整率的影响 由图9可得，2、3 g/L 大豆卵磷脂组精液中的精子在72 h 时全部死亡，且在其他时间点的精子质膜完整率低于另外两组（P＜0.05）。而其他浓度梯度大豆卵磷脂组精液中的精子依然具有质膜完整率，其中1 g/L 大豆卵磷脂组在各保存时间测定点的精子质膜完整率都高于其他浓度组。由图10 可得，添加了1 g/L 大豆卵磷脂组在各时间点的精子顶体完整率均高于其他组。

3 讨 论

由6 种初选稀释液配方的对比实验结果可知，山羊精液使用配方E 配制的稀释液保存效果最佳，F 次之。对比不同实验组可知，前两者除添加葡萄糖外，还等比例加入了果糖，其余4 种只加入单一种类的糖。曲宏伟等[11]研究发现，在阿拉善型绒山羊精液稀释液中混合添加葡萄糖与蔗糖2 种糖的实验组的精子保存效果显著优于添加单一蔗糖组；宣小龙等[12]研究发现，按照接近于1:1比例添加2 种不同的单糖作为夏洛莱绵羊精液稀释液营养剂效果比只加入葡萄糖的更优。蔗糖是非还原性二糖，是由一分子葡萄糖和一分子果糖在特定键位缩水而成，它被动物体摄入后在相关特定酶的作用下被分解成两分子葡萄糖参与供能或再被转化为肝糖原肌糖原储存在体内。本研究与已有发表的研究结果相同，可能是等比添加的葡萄糖和果糖在为精子供能方面优于添加单一的蔗糖，这有待更进一步研究。

图5 BSA 对山羊精子质膜完整率的影响

图6 BSA 对山羊精子顶体完整率的影响

图7 大豆卵磷脂对山羊精子活力的影响

图8 大豆卵磷脂对山羊精子保存时间的影响

图9 大豆卵磷脂对山羊精子质膜完整率的影响

图10 大豆卵磷脂对山羊精子顶体完整率的影响

常温条件下，在3 g/L BSA 与配方E 配制成的稀释液中，山羊精子活力的保持状况最好。Naijian 等[13]研究发现，在冷冻Tris 蛋黄稀释剂中加入10 g/L 或15 g/L BSA 对于Mahabadi 山羊精子都有较好的保存效果。Uysal 等[14]研究发现，添加20 g/L BSA 显著提高了冻融Akkaraman 公羊精子的活力以及顶体与质膜的完整性。Fu 等[15]研究发现，在公猪精液中添加4 g/L BSA的精子活力比添加2 g/L BSA 的要高，但相同浓度的BSA 和脱脂奶对公猪精液的保护作用没有显著差异。本研究同样证明，在精液稀释液中添加适量的BSA 可延长山羊精子的保存时间，然而本研究得出的最优添加浓度与文献报导的结果相异，这可能由基础稀释液配方和实验动物品种之间的差异导致。此外，添加4 g/L BSA 组的精子活力和保存时间低于其他组，说明过高浓度的BSA 对山羊精子有害。并且结果还显示，山羊精液稀释液中的适量BSA 能降低山羊精子质膜氧化损伤并提高其质膜的完整率，而对山羊精子顶体却没有保护作用。可能是作为抗氧化剂的BSA 能够降低精液中丙二醛（MDA）浓度，从而减少质膜的过氧化[16]，并保持DNA 的高度完整[17]。

本研究结果显示，在山羊精液稀释液中添加大豆卵磷脂达到1 g/L 时，精子的活力与细胞膜的完整性显著提高，精液的保存时间亦显著增长，但精子顶体完整率相对于其他浓度组并没有显著变化。当稀释液中大豆卵磷脂浓度达到2 g/L 或3 g/L 时，精子的活力下降增快、质膜完整率下降。栗瑞兰[18]研究发现，大豆卵磷脂浓度为1.5% 的精液稀释液中的内蒙古绒山羊精子DNA完整度最高，2.5% 组最低，之间的差异不明显。孟娜娜[19]研究显示，在4～5℃的保存温度下，稀释液中添加0.375%大豆卵磷脂绵羊精子保存的时效增强效果最好，但是大豆卵磷脂超过一定浓度后，精子的保存时间将随其浓度增加而逐渐变短。这可能是大豆卵磷脂难溶于水，当大豆卵磷脂浓度达到临界值后，其溶解能力变小，使得稀释精液变得黏稠，导致阻力增大，从而表现为精子能量消耗增高增快[20]。Akhter 等[21]和Singh 等[22]研究认为，过高浓度的卵磷脂将影响精子正常运动，并且对精子的生存性能产生了相当程度的不利影响。世界各地的大量研究都已经证明，在含有大豆卵磷脂的精液稀释液能提高精子的保存效果，但是各研究的具体结论都不尽相同。应基于产品纯度、生产批次、试验动物和精液处理方式等因素的不同进行针对性的调整才能得出具体的最佳添加浓度。

4 结 论

本研究在前人研究基础上比较了不同浓度梯度BSA 及大豆卵磷脂对山羊精子的保护作用，并根据其作用优化了山羊稀释液的配方。结果显示，在上述E 配方基础稀释液中添加3 g/L BSA、1 g/L 大豆卵磷脂的优化稀释液保存山羊精子的效果最佳。因此，每1 L 蒸馏水含有葡萄糖19 g、果糖19 g、柠檬酸二钠16 g、EDTA-Na21.7 g、BSA 3 g 或大豆卵磷脂1 g、青霉素钠和硫酸链霉素各100 万单位的常温精液稀释液，具有较好的山羊精子保存效果，最适合山羊人工授精使用。