不同含量伊维菌素长效透皮制剂在家兔体内的药代动力学研究

刘营营，岳治光，吴宁鹏，闫亚群，刘珍珍，张素梅，菅复春，王荣军，宁长申

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002； 2.河南安进生物技术股份有限公司，河南 郑州 450002； 3.河南省兽药监察所，河南 郑州 450008)

伊维菌素(Ivermectin,IVM)是目前中国使用最为广泛的抗寄生虫药之一，现已被制成口服剂、注射剂、胶囊剂、透皮剂、长效控释及缓释剂等多种剂型[1-10]。传统的给药方式有口服、灌胃、直肠内给药；皮下、腹腔、静脉、肌肉注射给药；浇泼剂、药膏涂抹、透皮剂等；透皮给药方式指药物通过皮肤，以一定的速度进入体循环，从而产生全身或局部治疗作用[11]。透皮给药最大的优点是避免了药物在肝脏系统的首过效应，而且给药简便、应激小[12-13]，对机体相对来说更加安全[14-15]。作者前期研制了伊维菌素长效透皮吸收制剂[16]，具有给药方便、减少动物应激、给药剂量可控、避免肝脏的首过效应和持效时间长的优点。本研究进行药代动力学试验测定血浆中伊维菌素的含量并建立相应的检测方法，探究伊维菌素在动物体内的药物时间质量浓度变化，以期为指导临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

长效伊维菌素透皮剂，本实验室与安进生物制药有限公司联合研制；伊维菌素标准物质(含量91.3%)和多拉菌素标准物质(96.0%)购于中国兽医药品监察所；乙腈、甲醇为一级色谱纯，购自德国默克股份两合公司；N-甲基咪唑、三氟乙酸酐购自美国Sigma试剂公司；乙酸、三乙胺和四氢呋喃购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

Waters e2695型高效液相色谱仪：美国Waters 公司；Waters 2475型荧光检测器：美国Waters 公司；Xp205型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司 ；Sigma 3-30K型台式高速离心机：上海创奕科教设备有限公司；TTL-DCⅡ型N2 吹干仪：美国Organomalion Associates Joc 公司等。

试验用兔18只，购自河南省郑州市巩义市米河镇高庙村中原玉花种兔经营部的40日龄纯种新西兰大白兔，试验前未用过大环内酯类驱虫药，平均体重2.5 kg，公母各9只。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及药物用法、用量 18只试验兔分为1、2、3组，分别为0.5%、1.0%、1.5%的伊维菌素透皮剂组，每组6只兔，公、母各3只。分别取含量为0.5%、1.0%、1.5%的伊维菌素透皮剂，按1.0 mg·kg-1剂量均匀喷撒于家兔外耳廓。给药前每只兔分别经耳缘静脉采血5 mL作空白对照，用药后分别于1 、2 、4 、12 、1 、2 、3 、5 、7 、9 、12 、15 、20 、25 、35 d 耳缘静脉采血2 mL。按照血浆样品处理方法处理后，置-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 标准工作液的配制 标准储备液的配制：精密称取伊维菌素标准品10.12 mg，用乙腈溶解并定容于50 mL容量瓶，配成终质量浓度为200 mg·L-1的标准储备液，4 ℃避光保存。

内标液的配制：精密称取多拉菌素(DRM)标准品25.71 mg，用乙腈溶解并定容于25 mL棕色容量瓶，配成终质量浓度为1 g·L-1的内标储备液，用乙腈稀释成0.2 mg·L-1的内标液，4 ℃避光保存。

系列质量浓度标准工作液的配制：取标准品储备液，用乙腈倍比稀释而成。

其他溶液的配制：衍生化试剂A的配制：N-甲基咪唑:乙腈的体积比为1∶1；衍生化试剂B的配制：三氟乙酸酐:乙腈的体积比为1∶2。

1.2.3 血浆样品处理 将采集后保存的血浆样品经室温自然解冻后，准确吸取1 mL于10 mL离心管中，加入100 μL内标液，加入2 mL乙腈去蛋白，涡旋振荡5 min后于4 ℃条件下12 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液l mL于10 mL离心管中，60 ℃ N2吹干。

1.2.4 衍生化方法 向残留物中加入衍生化试剂A 100 μL，涡旋混合30 s，加入衍生化试剂B 150 μL，立即盖好盖子，涡旋混合30 s。加入50 μL乙酸，50 μL三乙胺，涡旋30 s，加入650 μL流动相，混匀。0.22 μm滤膜过滤后，装入2 mL样品瓶，进样量为50 μL[17]。

1.2.5 HPLC测定条件 固定相色谱柱为Eclipse Plus C18 ( 250 mm×4.6 mm，5 μm )，流动相为乙腈∶水∶四氢呋喃的体积比为88∶8∶4，流速1 mL·min-1，进样量50 μL，柱温30 ℃，激发波长365 nm，发射波长475 nm[17]。

1.3 血浆中伊维菌素含量测定

1.3.1 色谱图处理结果 取给药前所采的家兔血浆为空白对照，其未曾用过阿维菌素类药物。之后对伊维菌素、多拉菌素单标色谱图单标确定其出峰时间分别为10.57、13.49 min，符合内标法要求(图1、2、3)。

图1 空白血浆色谱图Fig.1 The chromatograms of blank plasma

图2 IVM单标色谱图Fig.2 The chromatograms of IVM single-labeled

图3 DRM单标色谱图Fig.3 The chromatograms of DRM single-labeled

1.3.2 标准曲线的绘制 在9只10 mL离心管中，各加入900 μL空白血浆，然后再分别加入1 000、500、200、100、50、20、10、5、2 μg·L-1的标准液，涡旋混合，使各血浆样品中制得的伊维菌素质量浓度为100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg·L-1。按血浆样品处理方法和衍生化处理方法进行处理后，进样作HPLC分析。检测条件按2010版中华人民共和国兽药典[18]规定进行，以伊维菌素和内标峰面积之比作为纵坐标，伊维菌素的质量浓度为横坐标，做线性回归，得出标准曲线的回归方程和相关系数，并绘制标准曲线。

1.3.3 日内精密度和回收率测定 精密度和回收率测定是在900 μL空白血浆中，分别加入5、10、50 μg·L-1的IVM标准工作液100 μL，制得IVM质量浓度分别为0.5、1、5 μg·L-1，按血浆样品处理方法进行处理后，进样作HPLC测定。

每批(同日内)各质量浓度的样品重复测定5次，计算出回收率、日内变异系数；在7 d内共进行5个批次的测定，计算出回收率、日间变异系数[18]。

1.3.4 检测限和定量限的测定 按设备说明书进行测定。准确量取5个平行空白样品，测得基线噪音(基线峰高)平均值；计算所测样品的峰高(信号)平均值与基线噪音平均值的比值，取信噪比≥3时的质量浓度为最低检测限。取信噪比≥10时的质量浓度为最低定量限。

1.3.5 药时曲线拟合与药物动力学参数计算 对给药后的血浆药物质量浓度，用PK Solver药物代谢动力学软件残数法拟合药时曲线，计算药动学参数。各参数用平均值和标准差表示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线符合要求

以标准液质量浓度为横坐标，以外标峰面积和内标峰面积的比率为纵坐标绘制标准曲线图(图4)。

图4 伊维菌素和多拉菌素标准溶液标准曲线图Fig.4 Standard curves of ivermectin and doramectin standard solution

从图4可以看出，伊维菌素在0.2～100 μg·L-1范围内呈良好的线性关系。该标准曲线的回归方程为y=0.065 9x+0.037 6，R2=0.999 6，r=0.999 8，结果符合r≥0.90的要求，表明该方法可用于下一步检测。

2.2 精密度试验结果良好

依据高效液相色谱图伊维菌素峰面积，经计算，3个处理的质量浓度的日内精密度和日间精密度均小于6.82%，回收率均在90%～110%范围内，说明本试验精密度良好，结果见表1。

表1 血浆中添加3种不同质量浓度伊维菌素的精密度和回收率结果Table 1 The result of precision and recovery of ivermectin in plasma of 3 different mass concentrations

2.3 检测限和定量限的测定

依据信噪比≥3时的质量浓度为最低检测限。取信噪比≥10时的质量浓度为最低定量限，经试验测定，最低检测限为0.01 μg·L-1，最低定量限为0.02 μg·L-1。符合试验要求，灵敏、重现性好，可用作常规检测。

2.4 药时曲线拟合与药物动力学参数计算

2.4.1 血浆中伊维菌素的含量测定结果 内标法测定3组家兔血浆中伊维菌素的含量，根据血药质量浓度随时间的变化，绘制伊维菌素透皮溶液在家兔体内的药物质量浓度-时间表(表2)，从表2可以发现，3组药物进入机体后，首先缓慢的上升，达到峰质量浓度时开始缓慢下降，且第2组伊维菌素含量为1%的长效透皮剂组下降更为平缓。

表2 3组伊维菌素透皮溶液药物质量浓度与时间的关系Table 2 The relationship between drug concentration and time in three groups of ivermectin transdermal solution

2.4.2 药物动力学参数 通过药代动力学软件PK Solver对3组数据进行分析，计算出药代动力学参数吸收速率常数(ka)、消除速率常数(ke)、吸收半衰期(t1/2ka)、消除半衰期(t1/2ke)、达峰时间(Tmax)、峰质量浓度(Cmax)、平均滞留时间(MRT)、药时曲线面积(AUC)，3组药代动力学参数见表3。

表3 药代动力学参数Table 3 Pharmacokinetic parameters

3 结论与讨论

本研究选用高效液相色谱-荧光检测器，以多拉菌素为内标物质进行家兔血浆中伊维菌素的含量测定。优化了血浆中伊维菌素的提取过程及伊维菌素和多拉菌素的衍生化方法，筛选适宜比例的流动相，确保伊维菌素和多拉菌素色谱峰有效分离且在较短时间内出峰完毕，节约成本。本方法标准曲线在0.2～100 μg·L-1范围内线性良好，相关系数为0.999 8，日内精密度和日间精密度均小于6.82%，回收率均在80%～120 %之间，最低定量限可达0.02 μg·L-1，符合生物样品的分析要求。

本研究进行3组相同质量浓度不同体积的伊维菌素长效透皮剂在家兔体内的药代动力学测定，对家兔外耳廓单次均匀喷洒给药，通过血浆中伊维菌素质量浓度随时间的数据变化表明，药物可快速经皮肤吸收入血，发挥效应。通过PK Solver药动学处理软件对数据分析发现，其药动力学过程均符合一室模型，且消除半衰期分别为3.55、4.95和4.61 d。王敏儒等[19]报道的伊维菌素微球在家兔体内的药动学结果显示，消除半衰期t1/2ke为1.52 d。徐霞[20]研究报道的注射用伊维菌素脂质体单剂量1次皮下注射后，消除半衰期t1/2ke为6.5 d。说明本研究所用伊维菌素长效透皮剂在家兔体内消除半衰期较长，确有明显的长效作用。伊维菌素含量为0.5%、1.0%、1.5%的3种质量浓度的伊维菌素长效透皮剂在家兔血浆内均符合有吸收一室开放模型，且1.0%伊维菌素长效透皮剂组的吸收半衰期、达峰时间最短,平均滞留时间最长，效果最好。3种质量浓度的伊维菌素长效透皮剂在家兔体内有效质量浓度时间均长达35 d，有明显的长效作用。