敲除核因子E2相关因子对肾肌成纤维细胞活化与纤维化的影响

程水兵，郭洋洋，朱恒悦，肖言一，郑士樟，戚如意，周俊雷，杨梅，白永恒

（温州医科大学附属第一医院，浙江温州325015，1．创伤外科；2．浙江省胰腺肝脏危重性疾病诊治新技术研究重点实验室；3.重症医学科）

肾间质纤维化是肾脏损伤逐步进展的结果，同时也是造成肾脏功能减退不可逆的原因之一。典型的肾纤维化发生机制为各种原因（缺血缺氧、氧化应激等）引起转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）等促纤维化因子的过度产生和释放，诱导α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）阳性的肌成纤维细胞活化和积聚，最终导致大量的细胞外基质（如I型和III型胶原）成分在肾间质沉积所致[1]。然而，目前尚不十分清楚肾损伤过程中促纤维化因子如何被诱导产生，进而活化肌成纤维细胞。前期研究显示，氧化应激重要的调节分子—核因子E2 相关因子（nuclearfactorerythroid-2relatedfactor2，Nrf2）可能参与肾纤维化进程[2-3]。Nrf2 可以通过抗氧化和抑制炎症反应，从而实现减轻肾损伤，保护肾小管间质纤维化作用[4]。本研究通过体内应用Nrf2 基因敲除小鼠构建单侧输尿管梗阻（unilateralureteralobstruction，UUO）动物模型，观察敲除Nrf2对肾肌成纤维细胞产生和间质纤维化的作用，及敲除Nrf2对TGF-β1分泌水平的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 Nrf2（又称Nfe212）基因敲除小鼠（B6.129X1-Nfe212tm1ywk/J）购自南京大学南京生物医药研究院，动物许可证号：SCXK（苏）2015-0001。野生型B6小鼠（C57BL/6）购自温州医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（浙）2019-0009。PAS染色试剂盒购自上海太阳生物技术公司；Masson试剂盒购自北京Solarbio公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥公司；兔抗α-SMA抗体（美国CST公司）；兔抗TGF-β1 和III型胶原抗体（美国Bioworld公司）；TRIzol试剂，购自美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒，购自日本Toyobo公司；AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）；MyCycler梯度PCR仪（美国Bio-Rod公司）；7500Fast定量PCR仪（美国AppliedBiosystens公司）；VarioskanFlash全波长多功能扫描仪（美国ThermoScientific公司）；DM4000BLED荧光正置显微镜（德国Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型制备：将实验小鼠分成Nrf2野生型假手术组、Nrf2野生型UUO组、Nrf2敲除型假手术组、Nrf2敲除型UUO组4个小组，每组6只。UUO模型组进行左侧输尿管结扎，假手术组开腹后游离左侧输尿管不予结扎，于术后第7天取梗阻侧肾组织用于指标检测。UUO模型标准化关键在于无菌操作和结扎于输尿管上1/3处。

1.2.2 生化分析仪检测血肌酐和尿素氮水平：取每只小鼠的外周血，1500r/min离心10min分离出血清，全自动生化分析仪检测血肌酐和尿素氮水平。

1.2.3 PAS染色观察肾组织病理变化：梗阻侧肾取出后，进行纵轴和横轴测量。横截面切割切开后加入4%多聚甲醛固定，按常规方法进行组织脱水、透明、浸蜡和包埋。切成约4μm厚的切片，经脱蜡、梯度乙醇脱水，根据试剂盒说明书进行PAS染色，中性树胶封片。通过显微镜观察肾组织切片，对肾小管间质损伤程度进行评分，评分标准参照文献[5]。

1.2.4 Masson染色观察肾组织纤维化：石蜡切片脱蜡后，按试剂盒说明书操作。苏木素-三氯化铁染核10min；盐酸乙醇分化、水洗；氨水反蓝，水洗；丽春红酸性染液染色10min，醋酸洗1min；1%磷钼酸作用2min，直接用苯胺蓝染色2min；直接95%乙醇分化30s；脱水、透明、封片、镜检。Masson染色后肌纤维为红色，胶原纤维呈蓝色。评分标准参照文献[5]。

1.2.5 免疫组织化学染色检测TGF-β1、α-SMA和III型胶原的表达：用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化酶法。标本用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后连续切片，厚4μm。枸橼酸盐微波辐射进行抗原修复，二氨基联苯胺显色后经苏木精复染。以一抗稀释液代替一抗作为阴性对照，细胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达。光镜下每张切片随机选取10个高倍视野（×200），应用Image-ProPlus6.0软件，计算每个视野下阳性表达区域的平均光密度值（累积光密度/分析面积）。

1.2.6 RT-qPCR检测TGF-β1mRNA的表达：采用TRIzol试剂提取小鼠肾组织中的RNA，于260/280nm测定吸光度值以确定样本纯度和浓度。根据试剂说明书将RNA反转录成cDNA。应用Primer5.0软件设计小鼠TGF-β1mRNA的特异性引物，以β-actin作为内参，引物由上海生工公司合成，见表1。PCR扩增体系：5μL2×SYBRGreen荧光定量试剂、2μL引物（上、下游各1μL，终浓度200nmol/L）、2μL反应缓冲液、1μLcDNA。PCR程序为：95℃3min预变性，1 个循环；95℃5s，60℃35s，40 个循环。采用相对定量法计算获得结果，溶解曲线分析结果的可靠性。相对表达量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=

表1 TGF-β1和内参β-actin的mRNA引物序列

1.3 统计学处理方法 采用GraphPadPrism7.0软件对数据进行统计学分析，计量资料用表示，多组间的比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠肾功能比较 与Nrf2 野生型假手术组比，Nrf2野生型UUO组外周血清中血肌酐和尿素氮水平明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。Nrf2敲除型UUO组血肌酐和尿素氮水平与Nrf2野生型UUO组比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 4组小鼠肾组织损伤程度比较 与Nrf2野生型假手术组比，Nrf2野生型UUO组肾小管扩张和间质面积扩大，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2敲除型假手术组比，Nrf2敲除型UUO组肾小管扩张和间质面积扩大，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2野生型UUO组比，Nrf2敲除型UUO组肾小管扩张和间质面积扩大，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图1 4组小鼠肾功能比较

图2 4组小鼠肾组织损伤程度比较

2.3 4组小鼠肾组织纤维化的比较 与Nrf2野生型假手术组比，Nrf2野生型UUO组肾间质总胶原累积显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2敲除型假手术组比，Nrf2敲除型UUO组的胶原累积显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2野生型UUO组比，Nrf2敲除型UUO组肾胶原累积显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 4组小鼠肾组织纤维化的比较

2.4 4组小鼠肾组织肌成纤维细胞活化的比较 与Nrf2野生型假手术组比，Nrf2野生型UUO组肾组织α-SMA蛋白的表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Nrf2敲除型假手术组比，Nrf2敲除型UUO组α-SMA蛋白表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2野生型UUO组比，Nrf2敲除型UUO组α-SMA的表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

2.5 4组小鼠肾组织胶原累积水平比较 与Nrf2野生型假手术组比，Nrf2野生型UUO组III型胶原蛋白的表达水平显著增加，差异有统计学意义（P ＜0.01）。Nrf2敲除型假手术组比，Nrf2敲除型UUO组III型胶原蛋白表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2野生型UUO组比，Nrf2敲除型UUO组III型胶原蛋白的表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

2.6 4组小鼠肾组织TGF-β1表达水平比较 与Nrf2野生型假手术组比，Nrf2野生型UUO组TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2敲除型假手术组比，Nrf2敲除型UUO组TGF-β1表达水平明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Nrf2野生型UUO组比，Nrf2敲除小鼠UUO组TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

图4 4组小鼠肾组织肌成纤维细胞活化的比较

图5 4组小鼠肾组织胶原累积水平比较

3 讨论

核转录因子Nrf2 属于帽和领（Cap'n'Collar，CNC）亮氨酸拉链转录激活因子家族（CNC-bZIP）成员，可通过编码一系列抗氧化剂保护相关蛋白，调节多种细胞内氧化还原微环境，因此Nrf2成为细胞抗氧化应激的重要分子。多项研究表明，Nrf2与各种原因诱导的肾损伤及纤维化病变密切相关[2-4]。在链脲佐菌素诱发的糖尿病肾病中，Nrf2基因敲除会加剧小鼠肾损伤程度和纤维化[6]，而应用药物靶向提高Nrf2活性，则能减轻慢性肾损害与纤维化程度[7]。因此，Nrf2可能是人类肾脏疾病潜在的治疗靶点[8]。

本研究应用Nrf2基因敲除小鼠，通过构建UUO模型以形成纤维化，来研究Nrf2对肾肌成纤维细胞的活化与纤维化的影响。首先，本研究评价了敲除Nrf2对肾功能的影响，发现敲除Nrf2并未能明显下调肾功能。推测这一方面可能与标本量有关，另一方面可能与对侧肾的代偿作用有关。其次，与Nrf2野生型UUO组比，Nrf2敲除型UUO组肾损伤更明显，总胶原累积更严重。深入分析，Nrf2敲除型UUO组α-SMA的表达较Nrf2野生型UUO组更高，同时III型胶原的表达也明显增强。这些证据表明：Nrf2与肾损伤及纤维化呈现明显负相关。Nrf2可能通过抑制肾组织氧化应激反应，降低局部炎症损伤，缓解肾肌成纤维细胞活化和胶原积聚[4]。同时，Nrf2也可能通过调控巨噬细胞浸润和极化，抑制炎症小体形成，最终影响肾纤维化进程[9]。基于此，Nrf2可以 预防或者减轻包括砷、铬和镉在内的多种重金属引起的肾毒性[10-12]，也可以抑制免疫抑制剂环孢菌素A所致的TGF-β1表达增加，进而引起肾小管上皮细胞表型转化和间质纤维化[13]。

图6 4组小鼠肾组织TGF-β1表达水平比较

本研究也发现Nrf2 影响肾纤维化的机制与TGF-β1有关，TGF-β1是介导EMT最重要的诱导因子。对肾小管上皮细胞而言，TGF-β1可以通过细胞膜上受体TGF-β1R的介导，影响下游信号分子Smad2/3的磷酸化及入核表达，最终引起小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化[1]。同样，TGF-β1的作用也可以促进肾间质成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并诱导肌成纤维细胞的活化。在肺纤维化模型中，敲减Nrf2可诱导TGF-β1介导的表型转化和纤维化[14]。同样，在糖尿病肾病中Nrf2 可抑制TGF-β1 转录水平，进而缓解纤维化病变[15]。Nrf2对TGF-β1转录水平的调控主要是通过与转录因子c-Jun和SP1 的相互作用，进而结合到TGF-β1启动子的特定区域影响其转录[15]。本研究结果也支持了上述观点，即Nrf2 对TGF-β1及肌成纤维细胞表型转化的抑制作用。在构建的UUO模型中，肾TGF-β1mRNA和蛋白的表达均明显升高，敲除Nrf2可加剧TGF-β1的表达。因此，TGF-β1可能是Nrf2抗肾纤维化作用重要的下游分子靶点。