miR⁃200c在子宫内膜腺癌血清及组织中的表达及临床意义

于静 姜爱丽 张小妍 李丰玲 李连芹

滨州医学院烟台附属医院1病理科，2妇科，3生殖医学科（山东烟台264100）

子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，据报道2012年在世界范围内约有32万例新发病例［1］。在美国2019年估计有61 880 例子宫内膜癌新发病例，在妇女所有癌症的新发病例中排名第4位，其中死亡人数达12 160例，发病率持续上升［2］。miRNAs是一组内源性小的非编码RNA，它们通过转录后抑制基因表达或通过结合特定目标基因的3'末端非翻译区域（3'UTR）来影响多种生物过程［3-4］。最近的研究表明，miRNA 表达在肿瘤发生和发展中起着重要的作用［5-7］，miRNAs 最近受到了越来越多的关注。已有多项研究证实组织中miRNA 表达可作为癌症诊断或预后的生物标志物［8-10］，研究证实miR⁃200 家族成员是癌症重要的miRNAs，认为miR⁃200家族（包括miR⁃200a、miR⁃200b、miR⁃200c、miR⁃429、miR⁃141）是一个潜在的生物标志物，有重要的临床价值［11-12］。

笔者之前的研究发现，miR⁃200c 可靶向BMI⁃1基因抑制子宫内膜癌细胞侵袭和转移［13］，但目前尚未有关于miR⁃200c 作为诊断子宫内膜癌的生物标志物的研究。为了解miR⁃200c 对于诊断子宫内膜腺癌及判断预后是否具有临床意义，在之前的细胞研究基础上，本研究进一步探讨miR⁃200c 在子宫内膜腺癌血清及组织中的表达情况及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2016年1月至2018年12月滨州医学院烟台附属医院妇科住院手术治疗的子宫内膜腺癌标本及病例资料120 例，年龄45 ～76 岁，平均（55 ± 10.56）岁，同时收集同期在妇科门诊因异常子宫出血行诊断性刮宫病理结果为增殖期或萎缩型子宫内膜标本100 例为对照组，年龄（43 ～72）岁，平均（50 ± 15.19）岁。对照组与组患者年龄比较差异无统计学意义。纳入研究的患者术前均未经过放疗、化疗和激素等药物治疗，既往无其他恶性肿瘤病史。对纳入研究的子宫内膜腺癌病例根据世界卫生组织（WHO）提供的病理诊断标准及国际妇产科联盟2009年提供的FIGO 分期进行分期。详细记录所有纳入研究的患者基本资料及临床资料。经过滨州医学院烟台附属医院伦理委员会批准，所有纳入研究的患者其本人或家属均知情同意并签订知情同意书后进行。

所有纳入研究的对象均于手术前或诊刮操作前抽取清晨空腹静脉血5 mL，离心分离血浆后保存与-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器RNA 逆转录试剂盒和SYBER Green PCR 试剂盒均购自中国大连Takara试剂公司，miR⁃200c⁃3p 及U6 引物由中国上海吉玛有限公司合成。荧光定量PCR 扩增仪iQ5 系统进行RNA 的逆转录，Real⁃time PCR ABI 7500 系统进行实时定量荧光聚合酶反应（定量PCR）。miR⁃200c⁃3p 引物序列：上游引物：UAAUACUGCCGGG⁃UAAUGAUGGA；下游引物：CAUCAUUACCCGGCA⁃GUAUUAUU。U6 引物序列：上游引物：CTCGCTT⁃CGGCAGCACA 下游引物：AACGCTTCACGAATTT⁃GCGT。

1.2.2 总RNA 的提取及qRT⁃PCR 检测方法Trizol 试剂裂解组织和血清细胞方法提取总RNA，测量RNA 浓度，浓度在1.8～2.0 最佳。按照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录成cDNA，逆转录反应程序条件：25 ℃开始30 min；42 ℃30 min；85 ℃5 min；4 ℃保存，逆转录后cDNA-20 ℃保存。按照SYBER Green PCR 试剂盒说明书配制PCR 反应体系10 μL：U6 上、下游引物各0.25 μL，miR⁃200c⁃3p上、下游引物各0.25 μL，cDNA 6 μL，无RNA 酶DEPC 水3 μL。定量PCR 扩增反应条件：5 ℃预变性20 s；95 ℃变性10 s；60 ℃变性20 s；70 ℃延伸10 s；4 ℃保存。溶解曲线：95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s；60 ℃15 s；共40 个循环。采用相对定量法，以U6 为内参。采用2⁃ΔΔCt法计算miRNA 相对表达量，其中△Ct=Ct 目的基因⁃CtU6。

1.3 统计学方法所有数据均采用SPSS 23.0 统计软件分析。计量资料采用均数± 标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。绘制受试者工作特征曲线（ROC）评价血清及组织中miR⁃200c 的诊断价值。应用多元Logistic 回归模型分析miR⁃200c与子宫内膜腺癌的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜腺癌和正常对照组患者血清和组织中miR⁃200c 相对表达量比较RT⁃PCR 方法检测miR⁃200c相对表达量，实验过程中未出现非特异性扩增、污染或引物二聚体，检测结果可靠，见图1。子宫内膜腺癌组织和血清中miR⁃200c 相对表达量2⁃ΔΔCt平均值显著高于正常子宫内膜组织和血清中的表达，比较差异有统计学意义（P< 0.05）。见表1。

2.2 子宫内膜腺癌组织及血清中miR⁃200c 相对表达量与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系子宫内膜腺癌组织和血清中miR⁃200c 表达与临床分期、肌层浸润深度、是否淋巴结转移相关（P＜0.05）；miR⁃200c 在临床晚期、深肌层浸润和存在淋巴结转移的子宫内膜腺癌的组织中表达明显下降，而在临床晚期、深肌层浸润和存在淋巴结转移的子宫内膜癌患者的血清中表达增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。子宫内膜腺癌组织和血清中miR⁃200c 表达与患者年龄和分化程度无相关关系（P> 0.05）。多因素Logistic 回归分析发现，临床分期、肌层浸润、淋巴结转移均是影响miR⁃200c 表达的独立性危险因素。见表2、3。

表1 宫内膜腺癌和正常子宫内膜组织和血清中miR⁃200c相对表达量的比较Tab.1 Comparison of the relative expression of miR⁃200c in tissues and serum of endometrial adenocarcinoma and normal endometrial x±s

图1 miR⁃200c 扩增曲线（A）和溶解曲线（B）Fig.1 Amplification curve（A）and dissolution curve of miR⁃200c（B）

2.3 血清和组织中miR⁃200c 对子宫内膜腺癌的诊断价值血清和组织中miR⁃200c 诊断子宫内膜腺癌的曲线下面积（AUC）及95%CI分别为0.943（0.916 ～0.970）和0.949（0.924 ～0.973）与对照组（AUC=0.5）比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。miR⁃200c 诊断子宫内膜腺癌的敏感度较好，血清和组织miR⁃200c 敏感度分别为：76.5%和77.1%；但特异度差，分别为44.7%和30.73%。见图2、表4。

表2 血清和组织中miR⁃200c 相对表达量与子宫内膜腺癌患者临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between the relative expression of miR⁃200c and the clinicopathologica characteristics in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma ±s

表2 血清和组织中miR⁃200c 相对表达量与子宫内膜腺癌患者临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between the relative expression of miR⁃200c and the clinicopathologica characteristics in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma ±s

临床与病理特征年龄（岁）≤60＞60分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ分化程度G1/G2 G3肌层浸润＜50%≥50%淋巴结转移无 有例数28 92 93 27 85 35 91 29 87 33组织miR⁃200c 3.43±0.68 3.40±0.77 4.31±0.41 3.15±0.61 3.44±0.71 3.33±0.84 4.08±0.43 3.19±0.70 4.27±0.38 3.08±0.57 t 值0.192 9.393 0.705 6.422 11.01 P 值0.718 0.023 0.132 0.010 0.005血清miR⁃200c 2.51±0.70 2.36±0.77 2.13±0.61 3.32±0.40 2.43±0.72 2.33±0.84 2.17±0.69 3.11±0.44 2.06±0.56 3.30±0.38 t 值0.869 9.570 0.638 6.855 11.756 P 值0.752 0.014 0.151 0.014 0.003

表3 血清和组织中miR-200c 对子宫内膜腺癌临床病理特征的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of miR-200c and the clinicopathological features in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma

图2 miR⁃200c 诊断效能的ROC 曲线Fig.2 ROC curve of miR⁃200c diagnostic efficacy

表4 血清和组织中miR⁃200c 对子宫内膜腺癌的诊断价值Tab.4 The diagnostic value of miR⁃200c in serum and tissues in endometrial adenocarcinoma

3 讨论

目前有研究认为肿瘤外泌体的miRNA 表达谱与肿瘤负荷或疾病风险相关，外周血液循环系统或淋巴液携带大量的miRNA且分泌具有稳定性［14-16］。

最近有研究报道了血液循环中miRNAs 作为生物学标志物诊断卵巢癌和评价预后的临床相关性研究，认为miR⁃200c 是鉴别诊断卵巢肿瘤最敏感、最有特异性的标志物，甚至优于血清CA⁃125［12］。目前尚未有关于miR⁃200c 在子宫内膜腺癌中诊断价值的研究。

在之前的研究中笔者发现miR⁃200c靶向BMI⁃1基因抑制子宫内膜癌细胞侵袭和转移，因此推断miR⁃200c 可能是判断子宫内膜腺癌的临床预后的分子标志物。本研究通过检测正常子宫内膜和子宫内膜腺癌患者血清及组织中miR⁃200c 的表达，结果显示子宫内膜腺癌血清和组织中的miR⁃200c表达明显高于正常对照组。miR⁃200c在临床晚期、深肌层浸润和存在淋巴结转移的子宫内膜腺癌的组织中表达明显下降，而在临床晚期、深肌层浸润和存在淋巴结转移的子宫内膜腺癌患者的血清中表达增高。此项研究结果与WILCZYNSKI等［17］的一致，这表明miR⁃200c 可能是一个潜在的预后因素，可区分早期和晚期子宫内膜腺癌。Meta 分析数据表明，子宫内膜实体瘤组织中miR⁃200c 表达的缺失和血清中miR⁃200c 的升高与患者生存质量下降呈正相关［18］。本研究中miR⁃200c 在子宫内膜腺癌临床晚期和发生转移的组织和血清中的表达情况与Meta 分析的数据相同，也预示着预后不良。

miR⁃200c在癌症中的诊断价值目前已有报道。KIM 等［12］研究发现miR⁃145 和miR⁃200c 的上调表达是鉴别诊断卵巢肿瘤最敏感和特异性的标志物，表现优于CA125。有研究报道前列腺癌患者血清中miR⁃200c 表达的敏感度为67%，特异度为75%［19］。本研究中miR⁃200c 在子宫内膜癌患者血清中表达的敏感度高于报道中前列腺癌患者血清中的水平，特异度低于报道中前列腺癌患者血清中的水平。 Meta 分析研究发现，每项研究的样本量、miR⁃200c 的检测方法、样本类型和患者种族不同，检测血清中miR⁃200c 表达也有所不同，在胃癌患者血清中miR⁃200c 表达的敏感度范围为54.5%～97.0%，特异度范围为45.0%～100.0%［20］，因此在同种类型的癌症患者血清中miR⁃200c 表达的敏感度和特异度范围比较大。本研究发现miR⁃200c 在子宫内膜腺癌血清中的敏感度为76.5%、特异度为44.7%，敏感度在胃癌患者血清中的表达范围内，特异度低于胃癌患者血清中的范围。关于miR⁃200c在子宫内膜腺癌患者血清中的表达情况尚未有其他报道，无法对比分析。目前还不清楚是否有其他因素如体内雌激素水平影响正常子宫内膜或子宫内膜腺癌组织中miRNA的表达水平。KANGAS等［21］研究发现循环体外miR 家族可以作为代谢和炎症状态的指标，受更年期激素变化的影响。因此我们推断在本研究中miR⁃200c 诊断子宫内膜腺癌的敏感度可能受到了体内雌激素水平的影响。miR⁃200c 在乳腺癌［22］、肺癌［23］、卵巢癌［24］、结肠癌［25］等恶性肿瘤中均表达上调，因此笔者推断miR⁃200c在多种恶性肿瘤中表达上调，作为诊断子宫内膜腺癌的分子标志物特异性差。

综上所述，已有研究证实miR⁃200c是诊断恶性肿瘤的分子标志物，但本研究认为虽然血清miR⁃200c诊断子宫内膜腺癌敏感度较高但特异度较低，miR⁃200c 作为诊断子宫内膜腺癌的分子标志物证据不足。本研究在实验方法、样本量较小等方面尚有很多不足之处，尚需更深入的研究来进一步完善miR⁃200c作为子宫内膜腺癌的诊疗评估体系。