基于DSBs修复蛋白表达构建预测食管鳞癌放化疗预后的列线图模型

刘维 高辉 李华 李东 张涛

1西南医科大学临床医学院（四川泸州646000）；2西部战区总医院肿瘤诊治中心（成都610083）

食管癌发病率居我国第4 位，年发病人数28.67 万，约占全球55%，其中95%的病理类型为鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）［1-2］。根治性放化疗是食管鳞癌患者的标准治疗手段之一［3］。多个Ⅲ期临床研究表明，对于局部晚期食管鳞癌患者，与新辅助放化疗联合手术相比较，根治性放化疗的疗效并无差异，且不良事件显著降低［4］。因此，早期识别放化疗敏感人群，有助于食管鳞癌患者的治疗决策和远期生存的改善。

近年来，多项研究证实DNA 双链断裂损伤（DNA double⁃strand breaks，DSBs）修复能力与肿瘤放射敏感性及患者预后密切相关［5］。毛细血管扩张性共济失调症突变（ataxia telangiectasia mutat⁃ed，ATM）蛋白参与的同源重组（homologous recom⁃bination，HR）修复和DNA 依赖蛋白激酶催化亚单位（DNA⁃dependent protein kinase catalytic subunit DNA⁃PKcs）参与的非同源末端连接（non⁃homolo⁃gous end joining，NHEJ）修复是DSBs 修复的两条主要途径［6-7］；而P16 蛋白可以通过细胞周期素依赖性激酶4 抑制细胞周期，并与DSBs 修复蛋白Rad51 等相互作用，参与DSBs 修复［8］。然而，在根治性放化疗食管鳞癌患者中，尚无上述DSBs 修复蛋白的相关预后研究，也缺乏一个与临床病理因素相结合的远期生存预测模型。列线图（nomo⁃gram）是一种基于多因素回归分析，使用多个临床或生物指标，精准、可视化的预后评估方法，已广泛应用于多种恶性肿瘤。因此，本研究拟探讨食管鳞癌DSBs 修复蛋白ATM、DNA⁃PKcs 及P16 的表达水平与根治性放化疗后远期生存的关系，建立列线图预测模型，并验证其准确度，以期指导临床个体化治疗。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准纳入标准：（1）符合食管鳞癌诊断；（2）可获得诊断胃镜标本；（3）年龄18～80 岁；（4）不合并其他恶性肿瘤；（5）无严重心肝肾疾病；（6）未接受过任何肿瘤相关治疗；（7）在我院接受完整疗程的根治性放疗或放化疗；（8）病例资料完整无漏缺。

排除标准：（1）食管腺癌、小细胞癌等78 例；（2）无法获得诊断胃镜标本42 例；（3）大于80 岁患者12 例；（4）未完成放疗33 例；（5）缺失随访数据28 例。

1.2 一般资料自2012年6月至2017年12月，西部战区总医院肿瘤诊治中心收治经病理确诊并行根治性放化疗的食管鳞癌患者469 例。按上述标准共283 例患者纳入本次研究，并按比例（2∶1）随机分成建模组（n=189）和验证组（n=94），同时收集临床资料及初诊胃镜石蜡标本。参照2009年美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7 版分期标准和《非手术治疗食管癌临床分期标准（草案）》［9］，结合治疗前增强CT、吞钡造影和内镜检查进行临床分段分期。本研究通过了西部战区总医院伦理委员会的批准（批件号：2019ky56）。

1.3 治疗方法

1.3.1 放疗283 例患者均采用三维适形（3D⁃CRT）或三维适形调强（IMRT）技术，6 MV 或10 MV光子线。增强CT 模拟定位，参照ICRU62 号报告勾画靶区。大体肿瘤体积（gross tumor volume，GTV）为CT 结合钡餐、胃镜显示的大体肿瘤，其中阳性淋巴结定义遵照《中国食管癌放射治疗指南》［10］。临床靶体积（clinical target volume，CTV）在GTV 基础上前后左右方向各外扩0.5～0.8 cm，上下方向各外扩2 ～3 cm，仅包括累及淋巴结区域，而不行预防性照射。计划靶体积（planning target volume，PTV）在CTV 基础上均匀外扩0.5 cm。全组患者采用常规分割放疗，中位剂量60.0 Gy。

1.3.2 化疗85.5%（242/283）患者接受了化疗，其中18.6%（45/242）为同步放化疗，53.3%（129/242）为辅助化疗，28.1%（68/242）为同步+辅助化疗。化疗方案主要有TP 方案（紫杉醇/多西紫杉醇+铂类）、TPF（紫杉醇/多西紫杉醇+氟尿嘧啶+铂类）、FOLFOX（奥沙利铂+亚叶酸钙+氟尿嘧啶）、CP（伊立替康+铂类）等。中位化疗4周期。

1.4 随访及观察指标随访自治疗开始之日进行，每3 个月1 次，方式主要为门诊复查、病历查询及电话随访等，截止时间为2019年10月1日。全组患者中位随访时间36 个月，随访率100%。患者OS 的计算从确诊之日至随访结束或死亡，以月为单位。

1.5 免疫组织化学检测采用SP 法检测食管鳞癌胃镜标本ATM、DNA⁃PKcs 和P16 蛋白的表达水平。抗ATM、DNA⁃PKcs 单克隆抗体购自NOVUS公司（NB100⁃309、NB600⁃1203），抗P16 单克隆抗体购自Sigma 公司（MAB4133），SP 超敏免疫组化试剂盒以及DAB 显色剂购自博奥森有限公司。检测过程如下：石蜡切片常规脱蜡，微波修复10 min（柠檬酸钠修复液），3%H2O2孵育10 min，山羊血清封闭30 min，抗ATM（1∶100）、DNA⁃PKcs（1∶75）或P16 一抗（1∶100）4 ℃孵育过夜，PBS 漂洗后孵育二抗及二抗增强剂各15 min，DAB 显色，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗10 min，封片。

1.6 染色结果的判断采用半定量计分法［11］，随机选取10 个视野计数（×400），先按阳性着色程度评分：0 分为无着色，1 分为浅黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色；再按阳性细胞所占比例评分：阳性细胞比例< 25%为1 分，25% ～50%为2 分，50% ～75%为3 分，>75%为4 分；两者得分相乘，总分＜3分判定为阴性表达，否则为阳性表达。研究中所有的免疫组化染色均为盲法进行，所有的染色结果均由两名病理医生双盲判断，判断结果具有较好的一致性。

1.7 统计学方法采用SPSS 18.0 和R 3.5.1 统计软件进行数据分析，分类变量采用频数和百分比表示。采用χ2检验分析组间数据分布差异。采用Kaplan⁃Meier 法绘制生存曲线，Log⁃rank 检验进行单因素分析，Cox 比例风险模型进行多因素分析。采用R 软件中的rms 软件包绘制Nomogram 模型，Bootstrap 法进行内部验证，验证组进行外部验证；计算一致性指数（C⁃index），并绘制列线图预测与实际观察的生存率校准曲线。所有检验水准α=0.05（双侧）。

2 结果

2.1 全组患者预后至随访截止，全组患者死亡188 例，中位OS 为17 个月，3、5年总体生存率为34.6%、17.7%。其中死于疾病进展的96 例，死于大出血12 例，放疗相关性死亡18 例，其他原因死亡62 例。建模组患者死亡126 例，中位OS 为16个月，3、5年总体生存率为35.1%、20.0%。验证组患者死亡62例，中位OS为18个月，3、5年总体生存率分别为36.9%、18.7%（图1）。

图1 189 例建模组和94 例验证组病例的生存曲线Fig.1 Survival curves for 189 modeling and 94 validation sets

2.2 全组患者临床病理参数特征建模组189 例患者中位年龄为62 岁，其中149 例（78.8%）为男性；74 例（39.2%）为Ⅰ～Ⅱ期，115 例（60.8%）为Ⅲ期；92 例（48.7%）肿瘤长度小于6 cm；159 例（84.1%）接受了化疗。余临床及病理学特征见表1。与建模组相比，验证组患者上述临床病理参数差异无统计学意义（均P＞0.05，表1）。

2.3 建模组ATM、DNA⁃PKcs 及P16 蛋白表达情况免疫组化结果显示，ATM 蛋白表达于细胞质［12］，阳性率为57.7%（109/189）；DNA⁃PKcs 蛋白表达于细胞核［13］，阳性率为49.2%（93/189）；P16 蛋白表达于细胞核或细胞质［14］，阳性率为63.0%（119/189），见图2。

2.4 建模组患者远期生存预后分析单因素分析结果显示，性别、吸烟、饮酒、T 分期、N 分期、临床分期、ATM 表达、DNA⁃PKcs 表达和P16 表达均与患者的远期生存显著相关（均P＜0.05），而年龄、肿瘤部位、肿瘤长度、化疗与否和放疗剂量对患者远期生存无明显影响（均P＞0.05）。将单因素分析有意义的预后因子纳入Cox 风险比例模型中，结果显示，T 分期、N 分期、ATM 表达、DNA⁃PKcs 表达和P16 表达均是食管鳞癌放化疗后独立危险因素（表2）。

2.5 列线图模型建立与验证基于多因素分析结果，采用R 软件构建列线图模型（图3）。列线图预测总体生存率的C⁃index 为0.724（95%CI：0.657～0.791），而AJCC 第七版临床分期预测总生存率的C⁃index 为0.533（95%CI：0.455 ～0.655），显著低于列线图（P＜0.001）。校准曲线表明，列线图模型预测与实际观测预后结果吻合度较好（图4）。通过ROC 曲线确定cutoff 值为107.5 分，将建模组分为低危组69 例（0 ～107.5 分），高危组120 例（＞107.5 分）。Kaplan⁃Meier 生存分析显示，低危组患者的3、5年生存率为52.8%和34.77%，显著高于高危组的24.2%和9.7%（P＜0.001）。

表1 建模组与验证组临床病理特征参数Tab.1 Clinicopathological parameters of modeling group and validation group

表2 建模组远期生存多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of long⁃term survival of the modeling group

验证组的列线图和临床分期的C⁃index 分别为0.792（95%CI：0.718 ～0.865）和0.550（95%CI：0.445～0.655，P＜0.001），也提示列线图的预测的准确性较高。

3 讨论

自从RTOG 8501 研究奠定了以顺铂/5⁃FU+50.4 Gy 同步放化疗方案之后，根治性放化疗就成为不可手术，或局部晚期（T3-T4、淋巴结转移）食管鳞癌患者的标准治疗手段之一［15］。即便是近年来手术技术的不断发展，和新辅助放化疗研究的不断深入，包括FFCD9901 在内的多个研究仍然显示，根治性放化疗后患者远期疗效与新辅助放化疗联合手术类似，且不良事件显著减少［16］。此外，研究发现44.9%的患者新辅助放化疗后可达到病理完全缓解（pathologic complete response，pCR）［17］，提示此类患者进一步手术的必要性还有待于进一步探讨。因此，临床上迫切需要一个能够早期预测食管鳞癌患者放化疗敏感性及远期预后的个体化模型，以更好地进行治疗决策和预后判断。

图2 不同蛋白在食管鳞癌中的表达（SP×400）Fig.2 Expression of different protein in ESCC（SP×400）

图3 食管鳞患者总生存时间Nomogram 预测模型Fig.3 A nomogram to predict OS in patient with ESCC

图4 列线图预测食管鳞癌患者累积生存率的校曲线Fig.4 Calibration curve of nomogram predicting cumulative survival rate of ptient with ESCC

然而，目前常用的预后分期如AJCC 或日本食管协会（Japan Esophagus Society，JES）分期均基于术后患者［18-19］，对根治性放化疗患者的预后判断参考价值较小。ZHANG等［20］研究发现，治疗前炎性指标C 反应蛋白与血浆白蛋白的比值（CRP/Alb）具有一定的预测价值。吴盛喜等［21］建立了预测胸中段食管鳞癌患者根治性放化疗后远期生存模型，发现影响预后的主要因素是性别、N 分期、放疗剂量和近期疗效，其中近期疗效的权重最大。但该研究主要以近期疗效来预测远期生存，在早期预测放化疗敏感性和治疗决策方面有所不足。另外，> 60 Gy 放疗剂量对患者远期生存的影响还存在相当大的争议［22］。本研究显示，＞60 Gy 和≤60 Gy 组患者的5年OS 分别为21.5%和17.5%（P=0.841），提示放疗剂量对远期生存无显著影响。因此，为达到提前预测疗效，协助治疗决策的目标，本研究从DSBs 修复能力与放疗敏感性的角度出发，筛选出ATM、DNA⁃PKcs 及P16 3 个蛋白作为预测分子标记。

DSBs 是电离辐射诱导细胞死亡的主要损伤形式，其修复能力的高低与肿瘤放疗敏感性直接相关［23］。DSBs 修复主要有同源重组和非同源末端连接两种形式。ATM 蛋白是同源重组修复的主开关分子，并促进修复过程中复合物的形成，进而调控修复过程［6］。DNA⁃PKcs 蛋白是非同源末端连接修复中DSBs 的感受器，能识别断裂的DNA结构，启动修复程序［24］。抑癌蛋白P16 一方面直接作用于细胞周期抑制细胞增殖，另一方面可以通过TRIP12⁃RNF168⁃53BP1 途径，或阻碍同源重组中的关键分子RAD51 向DNA 损伤部位的聚集，导致修复障碍［25-26］。因此，ATM、DNA⁃PKcs 和P16蛋白表达水平与DSBs 修复能力密切相关。研究证实，在多种恶性肿瘤中，ATM 或DNA⁃PKcs 蛋白的表达与肿瘤放疗敏感性，以及患者的远期生存相关［27-28］；而在食管鳞癌中，P16 表达阳性的患者预后也更好［29］。本研究显示，食管鳞癌患者ATM、DNA⁃PKcs 和P16 蛋白表达阳性率分别为57.7%、49.2%和63.0%，阴性和阳性表达患者的中位OS 分别为25 和13 个月（P＜0.001）、28 和14 个月（P＜0.001）、13 和20 个月（P= 0.02），与其它肿瘤研究结果一致。

因此，本研究根据Cox 多因素分析结果，不仅纳入了T、N 分期等临床指标，还将与放疗敏感性相关的DSBs 修复蛋白ATM、DNA⁃PKcs 及P16 的表达纳入预测189 例根治性放化疗食管鳞癌患者远期生存的列线图模型中。结果显示，列线图的内、外部验证的C⁃index 分别为0.724 和0.792，而AJCC第七版临床分期的内、外部验证的C⁃index 分别只有0.533 和0.550，提示本列线图模型的预测准确度更有优势。同时，校准曲线也显示预测与实际观察的总体生存率一致性良好。以107.5 分为cut⁃off 值，建模组低危、高危患者的5年OS 分别为34.77%和9.7%（P＜0.001），而AJCC Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ期患者的5年OS 分别为31.9%和16.4%（P= 0.008），提示本列线图模型预测准确度更高。因此，本列线图模型可以依据诊断胃镜病理标本和临床病理参数，提前计算每位患者根治性放化疗的生存率，为进一步制定治疗计划提供了直观的、个体化的预后判断工具。今后随着样本量的增加和预后因素的细化，本模型将会得到进一步的优化以增加其准确性。

本研究也存在一定的局限性。首先，建立本列线图模型的数据取自单一中心且为回顾性研究，病例数较少，时间跨度大，存在一定程度的选择性偏倚，得出的结论可能会存在多种混杂因素的干扰。其次，本列线图模型生存分析的指标不够完善，未对局部控制率及远处转移率进一步分析。再次，ATM、DNA⁃PKcs 及P16 蛋白的表达能否作为根治性放化疗食管癌患者远期生存的独立预测因素还需要进一步扩大样本量验证，其涉及的具体分子机制有待进一步深入探讨。最后，本研究建立的列线图模型只是初步尝试，是否普遍适用于根治性放化疗食管鳞癌患者还有待于多中心前瞻性大规模的协作研究验证。

综上所述，本研究发现T 分期、N 分期、ATM、DNA⁃PKcs 及P16 蛋白的表达是根治性放化疗食管鳞癌患者远期生存的独立危险因素。与AJCC 临床分期相比，基于这5 个因素建立的列线图模型预测患者总体生存率准确率更高，并且能够更加直观地实现个体化预测，帮助治疗决策，具有较大推广价值。下一步将扩大样本量，纳入多中心患者进行验证，并探索纳入其它潜在预测分子以进一步提高模型的准确度和预测价值。