Bad联合Caspase⁃8促凋亡基因共表达对SK⁃HEP⁃1肝癌细胞体外增殖、凋亡、迁移和体内成瘤影响的实验研究

鲁斌 程敏 周凡

1安徽医科大学附属巢湖医院肝胆外科（安徽巢湖238000）；2南昌大学第二附属医院（南昌330006）

肝癌是一种高发恶性肿瘤，全世界每年新增肝癌患者约60 万例，全球超过50%的肝癌新发病例在我国［1］。晚期转移性肝癌预后差，无治愈可能，中位生存期不足12个月［2］。细胞凋亡与肝癌发生发展关系密切，而如何有效诱导肝癌细胞凋亡成为近年来肝癌研究热点，例如组织工程技术［3］。Bad 和Caspase⁃8 是促细胞凋亡关键蛋白，能 正反馈调控细胞凋亡信号传导，进而诱导细胞凋亡发生［4-5］。本研究拟利用基因重组技术构建Bad⁃Caspase⁃8 共表达基因，评估Bad 和Caspase⁃8 蛋白过表达对SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和体内移植成瘤效果影响，探究其作为肝癌治疗靶点的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂人SK⁃HEP⁃1 人肝癌细胞系购自南京科佰生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶和细胞培养用双抗试剂均购自美国Gibco 公司，细胞培养耗材购自美国Thermo Scientific 公司，CCK⁃8 检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，Annexin V⁃FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；鼠抗人单克隆Bad 抗体、鼠抗人单克隆Caspase⁃8抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG 二抗均购自美国CST 公司，兔抗鼠β⁃actin 单克隆抗体购于美国Santa Cruz 公司。通用型蛋白电泳仪（164⁃5070）采用美国Bio⁃Rad 公司产品。本研究委托上海吉凯基因公司设计合成Bad⁃Caspase⁃8 融合基因及转染用慢病毒。本研究通过医院伦理委员会批准，批件号：2016HZ0031。

1.2 Bad⁃Caspase⁃8融合基因构建及慢病毒包装pubmed 基因数据库查询Bad 和Caspase⁃8 基因信息，设计并化学合成Bad⁃Caspase⁃8 融合基因序列，PCR 扩增，靶向克隆至慢病毒GV238 载体中，上游引物序列：5'⁃CGACAAAAGCAAATGCGACAC⁃3'，下游引物序列：5'⁃CCTATTATTTCCACGTAGTCTC⁃3'，PCR 反应条件为：95 ℃预变性120 s；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环35 次。取适量菌液，进行基因测序，比对分析目的基因序列，抽提质粒，包装过程由自失活型慢病毒包装系统完成，将Bad⁃Caspase⁃8 融合基因载体质粒和包装质粒共转染239T 细胞，转染48 h 后，高速离心，收集含Bad⁃Caspase⁃8 融合基因慢病毒颗粒的239T细胞上清液，-80 ℃保存。

1.3 细胞体外转染SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞5×105个/mL 种植6 孔板中，每孔2 mL。吉凯基因公司推荐的SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞最佳转染复数为75⁃100，实验组：5 μg/mL Polybrene+50 μL Bad⁃Caspase⁃8 融合基因重组病毒上清液，对照组：5 μg/mL Polybrene+50 μL 阴性对照病毒上清液，空白组：相同体积细胞培养液。本慢病毒转染质粒中含有GFP 基因，可利用荧光显微镜下观察细胞转染情况，流式细胞仪检测基因转染效率。

1.4 蛋白质免疫印迹法检测蛋白表达提取细胞蛋白，BCA 法测定样品中总蛋白浓度，上样量40 μg，110 v 电泳，300 mA 电压湿转2 h，5%脱脂奶粉室温（25 ℃）封闭2 h，剪膜，加入Bad 抗体（一抗）和Caspase⁃8 抗体（一抗），1∶500 洗膜缓冲液稀释，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记羊抗鼠二抗，1∶1 000 洗膜缓冲液稀释，室温孵育2 h，1∶3 000 稀释β⁃Actin 蛋白作为内参，显色定影，杂交条带分析。

1.5 CCK⁃8 检测细胞增殖情况转染后72 h，在96 孔板中接种100 μL 细胞悬液，每组6 孔，置于37 ℃细胞培养箱中预培养2 h，每孔加入10 μL CCK⁃8 溶液，培养箱内孵育3 h，酶标仪测定吸光度（450 nm），每孔复测3 次。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况胰酶消化，离心，每管收集2×105个细胞，将细胞重悬于200 μL Binding Buffer。加入10 μL Annexin V⁃FITC 和5 μL PI，轻轻混匀，4 ℃避光反应30 min。加入300 μL Binding Buffer，上机测定各组细胞凋亡率。

1.7 细胞迁移实验细胞转染72 h 后，Transwell上室中加入100 μL 各组细胞悬液，细胞浓度为1×105个/L，下室加入600 μL细胞培养液。Transwell小室孔径8 μm，24 h 后，取出Transwell 小室，PBS清洗2 次，然后用95%乙醇固定15 min。PBS 清洗2 次，结晶紫染色30 min，PBS 清洗2 次，用棉签擦去上室表面附着细胞，倒置显微镜下随机取左、右、上、下、中心5 个视野，记录穿膜细胞数，计算各组平均数。

1.8 评估体内移植成瘤效果转染72 h 后，胰酶消化，1 000 r/min 离心，1640 培养液重悬细胞，调整细胞浓度至1 × 108个/mL，注射于裸鼠背部皮下，按照细胞处理分组，每组4 只，每只注射0.2 mL 细胞悬液，细胞总数约2 × 107个，每3 天卡尺测量瘤块长径（a）和短径（b），单位cm，肿瘤体积=0.5×a×b2，接种15 d 处死裸鼠，完整取出肿瘤对比分析。

1.9 统计学方法研究结果以均数±标准差表示，采用单因素多样本方差分析进行多组间均数比较，采用t检验分析进行组间两两比较，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染率慢病毒转染SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞效率达到87.7%，荧光显微镜下观察到满视野绿色荧光（GFP）分布，这种高转染效率为其后续实验应用奠定基础。

图1 体外慢病毒转染SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞效率Fig.1 SK⁃HEP⁃1 hepatoma cells were transfected by lentivirus in vitro

2.2 Bad和Caspase⁃8蛋白表达情况转染72 h后，蛋白质免疫印迹法检测，实验组Bad 和Caspase⁃8蛋白表达水平均显著高于对照组和空白组（图2）。

图2 各组Bad 和Caspase⁃8 蛋白表达Fig.2 The expression of Bad and Caspase⁃8 protein in each group

2.3 细胞增殖活性变化细胞转染72 h 后，与对照组和空白组相比，实验组细胞增殖能力明显降低，实验组、对照组和空白组OD值分别为0.86 ±0.122、1.89±0.315 和2.01±0.194，（F=40.314，P<0.001，图3）。

图3 转染后细胞增殖活性Fig.3 Cell proliferation after transfection

2.4 细胞凋亡情况转染72 h 后，与对照组和空白组相比，实验组细胞凋亡率明显增加，实验组、对照组和空白组细胞凋亡率分别为（31.6±2.8）%、（3.2 ± 0.9）%和（2.9 ± 1.1）%，（F= 248.023，P<0.001），对照组和空白组相比差异无统计学意义，（t=0.366，P=0.733，图4）。

图4 细胞凋亡率测定Fig.4 The measurement of cell apoptosis

2.5 细胞迁移情况转染72 h 后，与对照组和空白组相比，实验组细胞迁移数目明显降低，实验组、对照组和空白组细胞迁移数分别为18 ± 3，77±10 和85±11，（F=85.833，P<0.001，图5）。

图5 各组细胞迁移情况Fig.5 Cell migration in each group（×）

2.6 体内成瘤效果裸鼠皮下注射后，对照组和空白组裸鼠移植瘤注射生长迅速，6 d 后呈现指数曲线快速生长，到第15 天平均肿瘤体积分别达到（4.4 ± 0.29）cm3和（4.9 ± 0.42）cm3，而实验组裸鼠肿瘤生长较缓慢，到第15 天平均肿瘤体积仅为（1.6±0.17）cm3，差异有统计学意义，（F=133.443，P<0.001，图6）。

图6 体内移植瘤生长曲线分析Fig.6 Growth curve analysis of the transplanted tumor in vivo

3 讨论

细胞凋亡由内外源因素触发死亡程序而导致的细胞死亡过程［6］。细胞凋亡异常与肿瘤起源、进展及预后密切相关，凋亡抑制或减弱是多种癌症的共同表现，诱导凋亡是目前靶向治疗的主要策略之一。研究［7］证实，肝癌细胞凋亡与淋巴转移、组织学分级和临床分期均存在显著相关性，因此直接干预肿瘤细胞凋亡有望成为肝癌治疗新手段。

Caspase 家族是细胞凋亡的执行者，通过级联反应触发细胞凋亡。Caspase⁃8 蛋白是细胞凋亡死亡受体途径的终末剪切酶，通过与死亡配体相似的Caspase 途径和线粒体依赖途径激活Caspase⁃3，从而介导细胞凋亡［8］。同时，活性Caspase⁃8 可作用于其他Caspase 成员和凋亡相关死亡受体信号通路，并降解相应的胞浆胞核底物，诱导细胞凋亡［9］。Caspase 蛋白表达与肝癌细胞增殖活性呈显著负相关［10］。如果Caspase⁃8 活性异常或低下，则出现细胞凋亡异常，从而诱发肿瘤。Bad 蛋白属于bcl⁃2基因家族，Bad 活化后可直接穿透线粒体外膜，加速细胞死亡［11］。Bad 蛋白在肝癌组织中低表达而在正常肝组织中表达明显增加，Bad 蛋白水平与肝癌进展呈负相关［12］。

在本研究中，笔者利用基因重组技术构建Bad⁃Caspase⁃8 靶向共表达融合基因，通过慢病毒转染肝癌细胞，并随机整合到宿主基因组中，使其持续表达Caspase⁃8 和Bad 蛋白。SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞株是肝癌研究常用种子细胞，其贴壁生长，细胞活性好，容易转染。本研究GV238 慢病毒载体转染效率高达80.6%，甚至高于国外学者HORIBE 等［13］报道的同类型转染效率。转染72 h 后，实验组Bad和Caspase⁃8 蛋白表达明显增强，这表明融合基因整合至细胞基因组并成功转录翻译相关蛋白，为后续实验奠定基础。其次，Bad 和Caspase⁃8 蛋白过表达显著降低SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞增殖活性，明显增加细胞凋亡，这表明Bad 和Caspase⁃8 蛋白过表达对于SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞生长活性起着负性调控作用。恶性肿瘤的转移往往是肿瘤治疗失败的主要原因，也是晚期肿瘤患者预后不良的主要因素［14］。过去国内外学者致力于miRNA 技术调节wnt 信号通路抑制转移发生，但是miRNA 随着时间延长而降解失效，且容易出现干扰和误差［15］。Bad和Caspase⁃8 基因作为其蛋白表达上游调控因素，直接作用于基因表达，增加下游促凋亡蛋白合成，显著促进细胞死亡［16］。同时，细胞凋亡涉及到肿瘤转移过程中的多个关键步骤，包括瘤细胞脱离原发瘤、逃避免疫细胞杀伤及在远隔脏器定植等［17］。通过增加肿瘤细胞凋亡，可同时抑制其转移行为，诱导癌细胞处于长期静止和休眠状态，有可能实现长期带瘤生存［18-19］。本研究观察Bad 和Caspase⁃8 蛋白过表达后，导致SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞迁移数降低，提供一种抑制肝癌转移的新思路。最后，对照组和空白组肿瘤生长迅速，而实验组肿瘤体积注射后虽有所增加，但呈现肿瘤抑制生长状态，从而有效验证了本研究预想。本研究存在一定局限性，首先Bad 和Caspase⁃8 蛋白表达受多种基因和调控蛋白影响，可能出现基因和蛋白表达不一致情况；其次，不同的调控网络可能在不同的细胞类型和器官中产生不同的生物学效应［20］，本研究只采用SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞株作为研究对象，存在选择偏倚，是否在人体内Bad 和Caspase⁃8 蛋白过表达也能很好发挥抗肝癌作用有待于进一步研究。

综上，通过基因重组技术构建Bad⁃Caspase⁃8融合基因，可明显增强促凋亡因子Bad 和Caspase⁃8 蛋白表达，显著降低SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞增殖活性，促进SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞凋亡，减少SK⁃HEP⁃1肝癌细胞迁移，抑制SK⁃HEP⁃1 肝癌细胞体内成瘤效率，可作为肝癌靶向治疗潜在靶点。