高效液相色谱法测定饮用水中草甘膦的不确定度评定

余秀娟 樊继鹏 王伟伟 魏晓培 顾娟红

(1.苏州海关综合技术中心，江苏 苏州 215104；2. 苏州华博日化品检测服务有限公司，江苏 苏州 215104)

草甘膦，化学名为N-(膦酰基甲基)甘氨酸，化学分子式为C3H8NO5P，又称为镇草宁、农达、草干膦、膦甘酸，属于弱有机酸，是一种常用的水溶性除草剂，纯品为非挥发性白色固体，不溶于一般有机溶剂，不可燃，不爆炸，常温下可以稳定贮存。草甘膦为内吸传导性强的广谱灭生性除草剂，在农业上大量使用的草甘膦除草剂，只有极少部分发挥了作用，多数残留在土壤或漂浮在大气中，通过降雨和径流的冲刷进入地表水或地下水，造成水体污染。随着草甘膦使用频率不断上升，其残留问题日益受到关注。长期饮用含有草甘膦农药的水，会危及人体健康，并会造成肝肾、消化道黏膜、皮肤黏膜、神经系统、呼吸系统和心血管系统的损伤，严重者可危及生命。因此，草甘膦的检测技术一直是草甘膦污染防治关注的焦点。目前草甘膦的测定方法主要有气相色谱法、气相色谱质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、分光光度法、酶联免疫法、毛细管电泳法、离子色谱法等，其中最常用的方法是高效液相色谱法[1-3]。为了快速、准确测定生活饮用水中痕量草甘膦，保证生活饮用水卫生安全、保护人体健康，本文建立超高效液相色谱-柱后衍生法测定饮用水中草甘膦的检测方法，对所建立方法测定草甘膦的不确定度进行了评定。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和设备

LC 1260 液相色谱仪，配有自动进样器(美国 Agilent 公司)；色谱柱：Potassium Cation Exchange柱(150 mm×4.0 mm，8 μm，PICKING公司) ；Milli-型超纯水机(Merck Millipore中国有限公司)；PVDF 针式滤器：25 mm×0.22 μm(上海安谱实验科技股份有限公司)。

1.2 试剂

草甘膦标准溶液：100 μg/mL(北京坛墨质检科技有限公司)；甲醇：HPLC级，纯度不低于99.9(德国Merck公司)；K200(0.4%H3PO4、0.1%KH2PO4、99.5%H2O)、RG019(0.3%KOH、99.7%H2O)、GA116(0.1%NaOH、0.1% KH2PO4、1% NaCl、98.8%H2O)、GA104(5.4%KBO3、94.6%H2O)、邻苯二醛、2-巯基乙醇、草甘膦恢复液(4.1% H3PO4、0.3% KH2PO4、95.6%H2O)；10.0%次氯酸钠(PICKING公司)；5%次氯酸钠(国药集团)；实验用水为纯水。

1.3 分析方法

1.3.1 柱后衍生仪器条件

柱后衍生反应器温度：36℃；泵流速：0.30 mL/min；衍生剂1：吸取100 μL溶于1000 mL稀释剂GA116中。衍生剂2：称取100 mg 邻苯二醛溶于10 mL甲醇中，称取2.0g 2-巯基乙醇溶于5 mL稀释剂GA104中，然后将二者全部溶于1000 mL稀释剂GA104中，通氮气脱气10 min。

1.3.2 液相色谱仪器条件

柱温：55℃；流量：0.40 mL/min；进样体积：20 μL；流动相：通道A=K200，100.0%，通道B=RG019，0.00%；梯度洗脱程序：初始 A:B(体积比)=100:0；15.1 min 时，A:B(体积比)=0:100；17.1 min 时，A:B(体积比)=100:0；检测器：FLD；检测波长：激发波长Ex=330 nm，发射波长Em=465 nm。

1.4 不确定度来源分析及数学模型的建立

依据JJF 1059.1-2012[4]，本方法的不确定度来源主要有：B类不确定度：(1)标准溶液引入的不确定度urel(1)；(2)标准曲线回归引入的不确定度urel(2)。A类不确定度：(3)重复性测定产生的不确定度urel(3)。对这些来源产生的不确定度进行量化，本方法的不确定度数学模型为：

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

准确吸取1.0 mL 草甘膦标准溶液于10.0 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成浓度为10.0 μg/mL的标准使用液。稀释标准使用液配制成浓度为 0.025、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 μg/mL的标准曲线，按照1.3中的仪器条件进行测定，外标法定量。线性范围为0～2.0 μg/mL，线性回归方程为Y=27.10205*X-0.150174，相关系数0.9999，保留时间8.602 min(图1)。

图1 标准样品谱图

2.2 准确度和精密度试验

用阴性自来水样品分别添加标准溶液配制成0.10、0.40、2.00 μg/mL三个浓度水平的样品，每个水平进行6次重复试验，结果见表1。平均回收率在98.0%～105.0%之间，相对标准偏差在0.7%～5.5%，以3倍信噪比(S/N=3)确定方法的检出限，本方法检出限为0.025 μg/mL。该方法检出限满足生活饮用水中草甘膦的日常检测要求。

表1 回收率和精密度试验结果

2.3 样品分析

用棕色磨口玻璃瓶采集水样，采样时水样充满玻璃瓶。当余氯存在时，加入硫代硫酸钠，使其在水中的浓度达到100 μg/mL。水样采集后，将样品溶液于4℃避光保存，并在两周内测定。分析时，水源水需30000转/min的转速下离心5min， 取上清液用PVDF针式滤器将样品溶液过滤，同标准曲线一起上机测试；出厂水、管网水等清洁水直接用PVDF针式滤器将样品溶液过滤，同标准曲线一起上机测试。笔者用所建立的方法分别测定了自来水和水源水样品各10个，均未检测到草甘膦。

2.4 不确定度评定

2.4.1 标准溶液及配制引入的不确定度urel(1)

草甘膦标准溶液浓度为100 μg/mL，测定的标准不确定度为3.0 μg/mL，则相对标准不确定度分量为：u(1)=3.0/100=0.03。配制标准曲线时，标准使用液为10.0 μg/mL，稀释10倍使用，则urel(1)=0.03/10=0.003。

2.4.2 标准曲线回归引入的不确定度urel(2)

草甘膦的标准曲线测定结果见表2。实测值与理论值一一对应关系见表3。

表2 草甘膦的标准曲线测定结果

表3 实测值与理论值对应关系

配制浓度为0.1 μg/mL的标准样品平行测定6次，响应值分别为2.4024、2.7624、2.8335、2.7177、2.6327、2.7919，代入标准曲线得到的浓度分别0.094 μg /mL、0.107 μg /mL、0.110 μg /mL、0.105 μg /mL、0.103 μg/mL、0.108 μg/mL，其标准不确定度为：

草甘膦标准曲线拟合产生的相对标准不确定度为：urel(2)= u(2)/0.105=0.3905。

2.4.3 重复性测定产生的不确定度urel(3)

实验室人员操作的重复性、仪器进样的重复性、数据软件处理的重复性等因素组成了重复实验不确定度的来源[5-8]。本实验室重复测定6次，加标样品测定结果分别为0.094 μg/mL、0.107 μg/mL、0.110 μg/mL、0.105 μg/mL、0.103 μg/mL、0.108 μg/mL，其平均值为0.105 μg/mL，其标准偏差为0.006 μg/mL。

2.4.4 合成标准不确定度

将所有不确定度分量进行合成，则相对合成标准不确定度

合成不确定度u=0.105×0.3912=0.0412 μg/L

取扩展因子k=2，扩展不确定为：U=0.0412×2=0.0824 μg/L，则草甘膦的测定结果应表示为：(0.105±0.0824)μg/L，k=2。

3 结论

本文采用高效液相色谱法测定饮用水中草甘膦，方法操作简便，选择性好，灵敏度高，定量准确，分析时间短。对该方法进行不确定度评定，结果表明B类不确定度中标准曲线回归引入的不确定度影响最大，A类不确定度重复性测定产生的不确定度影响次之，因此应充分重视标准工作溶液的配制，规范各项操作。分析前，将仪器各项参数调试至最佳状态，减小由仪器问题带来的结果偏离。