艾拉莫德对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡及炎症因子水平的影响

穆培霞，马 玲，付冬冬，杨学华，吕书龙，吴 洁，范文强

1)新乡市中心医院特需二科 河南新乡453000 2)新乡市中心医院风湿免疫科 河南新乡 453000 3)新乡市第二人民医院肾病风湿科 河南新乡 453000 4)新乡市中医院风湿科 河南新乡453000

类风湿关节炎主要以侵蚀性、慢性关节炎为主要表现，是一种自身免疫性疾病。滑膜组织异常是类风湿关节炎发生的关键，其中滑膜细胞凋亡障碍和炎症因子分泌是类风湿关节炎发生的主要原因[1]。艾拉莫德是一种抗风湿新药，具有抗炎、抑制免疫球蛋白产生等作用[2]。有报道[3]显示，艾拉莫德可改善类风湿关节炎关节疼痛，并且对于类风湿关节炎滑膜细胞增殖和免疫功能具有调节作用。该研究观察了艾拉莫德对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡和炎症因子分泌的作用，探讨艾拉莫德治疗类风湿关节炎的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料收集2018年1至8月新乡市中心医院膝关节置换手术切除的类风湿关节滑膜组织，标本采集经患者及家属知情同意。艾拉莫德购自海南先声药业有限公司，胞质蛋白提取试剂盒、线粒体蛋白提取试剂盒购自美国Sigma公司，活化的Caspase-3(C-Caspase-3)抗体、Bcl-XL抗体、NF-κBp65抗体购自美国Abcam公司，细胞色素C抗体购自碧云天生物技术有限公司，IL-1β含量检测试剂盒、TNF-α含量检测试剂盒均购自上海康朗生物科技有限公司。

1.2类风湿关节炎滑膜细胞的分离培养参照文献[4]，滑膜组织以PBS洗涤后剪成约1 mm3的碎块，添加0.8 g/L Ⅱ型胶原酶，37 ℃孵育4 h。1 000×g离心10 min，吸弃上清，添加2.5 g/L胰蛋白酶，37 ℃孵育0.5 h。以120目的滤网过滤，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM细胞培养液悬浮细胞，置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。取第3代滑膜细胞用于后续实验。

1.3细胞分组处理滑膜细胞分别用含艾拉莫德终质量浓度为0、600、1 200、1 800 μg/L[5]的培养液培养48 h。

1.4Annexin-V FITC/PI双染法测定细胞凋亡取4组细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。移液枪吸取1 mL细胞悬液，以200 μL结合缓冲液悬浮细胞，添加PI和 Annexin-V FITC染液5 μL，避光、室温下静置20 min，加300 μL缓冲液，上流式细胞仪检测，计算凋亡率。实验重复3次。

1.5ELISA法测定细胞培养液中IL-1β、TNF-α含量取4组细胞的培养液，采用ELISA法测定IL-1β、TNF-α含量，按照试剂盒说明操作。实验重复3次。

1.6Western blot法测定细胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65以及胞质和线粒体中细胞色素C蛋白的表达取4组细胞，分别提取细胞总蛋白、胞质蛋白和线粒体蛋白。取总蛋白与上样缓冲液混匀后，100 ℃反应5 min。按照每孔40 μg蛋白样品上样，设置80 V电压电泳约30 min，调整电压到120 V，观察溴酚蓝进入到凝胶底部，终止电泳。取出蛋白凝胶，转膜，然后将NC膜放在50 g/L牛血清白蛋白溶液中孵育2 h，依次加一抗(C-Caspase-3、Bcl-XL和NF-κBp65抗体，稀释比例分别为1∶400、1∶600、1∶400)、二抗(稀释比例为1∶2 000)充分孵育。ECL显色后，用Image J扫描条带灰度值，分析蛋白表达变化。同上方法检测胞质和线粒体中细胞色素C蛋白的表达(一抗稀释比例为1∶800)。细胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65以及胞质中细胞色素C蛋白的表达以GAPDH为内参，线粒体中细胞色素C蛋白的表达以Porin为内参。目的蛋白表达水平为目的条带与内参条带灰度值的比值。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。4组间以上各指标的比较采用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组细胞凋亡率和培养液中IL-1β、TNF-α含量的比较不同剂量艾拉莫德处理后，滑膜细胞凋亡率升高，细胞培养液中IL-1β、TNF-α含量降低(表1)。

表1 4组细胞凋亡率及培养液中IL-1β、TNF-α含量的比较(n=3)

*：与0 μg/L艾拉莫德组比较，P<0.05；#：与600 μg/L艾拉莫德组比较，P<0.05；△：与1 200 μg/L艾拉莫德组比较，P<0.05

2.2各组细胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65及胞质和线粒体中细胞色素C蛋白表达水平的比较见图1～3和表2。

1～4:分别为0、600、1 200、1 800 μg/L艾拉莫德组

1～4:分别为0、600、1 200、1 800 μg/L艾拉莫德组

不同剂量艾拉莫德处理后，C-Caspase-3蛋白水平升高，Bcl-XL和NF-κBp65蛋白表达水平下降，滑膜细胞胞质中细胞色素C蛋白表达水平升高，线粒体中细胞色素C蛋白表达水平下降。

表2 各组细胞中C-Caspase-3、Bcl-XL、NF-κBp65及胞质和线粒体中细胞色素C蛋白表达水平的比较(n=3)

*：与0 μg/L艾拉莫德组比较，P<0.05；#：与600 μg/L艾拉莫德组比较，P<0.05；△：与1 200 μg/L艾拉莫德组比较，P<0.05

3 讨论

类风湿关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，能够侵袭并破坏局部关节组织，具有高致残率[5]。研究[6]显示，滑膜细胞功能异常改变是类风湿关节炎发生的重要原因，滑膜细胞能够释放多种炎症因子进入血液以及滑液中，这些细胞因子能够进一步刺激周围炎性细胞以及关节软骨细胞等释放更多的损伤因子而破坏关节软骨；另外，滑膜细胞凋亡障碍也是类风湿关节炎发生的关键。

艾拉莫德是一种具有抗炎以及免疫调节作用的小分子药物，属于对氧萘酮衍生物[7]。研究[8]显示，艾拉莫德具有显著的抗关节破坏功效，能够减轻组织炎症反应，可改善类风湿关节炎患者滑膜损伤[9]。本研究结果表明，艾拉莫德可诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡，同时抑制炎症因子的分泌。

研究[10-11]显示，细胞凋亡的发生与细胞内多种调控途径有关。线粒体凋亡途径是细胞发生凋亡的主要途径之一，其关键是线粒体中的细胞色素C释放入胞质，诱导下游凋亡蛋白的表达，从而诱导细胞凋亡。Caspase和Bcl-2蛋白家族是目前发现的与细胞凋亡关系最为密切的调控因子[12]。Caspase-3是位于细胞凋亡反应下游的凋亡执行因子，在细胞凋亡过程中发挥不可逆的诱导作用[13]。Bcl-XL是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白[14]。本研究结果显示，艾拉莫德处理后的类风湿关节炎滑膜细胞中线粒体细胞色素C蛋白表达水平降低，胞质细胞色素C蛋白表达水平升高，C-Caspase-3蛋白表达水平升高，Bcl-XL蛋白表达水平下降，说明艾拉莫德可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

NF-κB是一个多功能调节因子，对于细胞凋亡和炎症反应均有重要作用，其可以激活细胞中炎症因子表达，同时可以通过多种途径调控细胞凋亡发生[15-16]。研究[17]表明，Bcl-XL有NF-κB的结合位点，NF-κB激活可以引起Bcl-XL表达水平升高，从而抑制细胞凋亡。NF-κB激活可以抑制线粒体细胞色素C释放，从而抑制Caspase凋亡反应的发生[18]。NF-κB还可以直接诱导细胞中炎症因子如IL-1β、TNF-α的释放从而促进炎症反应的发生[19]。NF-κBp65是NF-κB功能发挥的关键亚单位，也是NF-κB信号通路激活的标志[20]。本研究结果显示，艾拉莫德可以减少类风湿关节炎滑膜细胞中NF-κBp65的表达，说明艾拉莫德可能通过抑制NF-κB激活调控线粒体凋亡途径，从而诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡，减少细胞炎症因子释放。

目前对于艾拉莫德在类风湿关节炎滑膜细胞凋亡和炎症因子释放中的具体调控机制还不明确，在以后的实验中会继续探讨。