微藻类胡萝卜素生物合成代谢途径的研究进展

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(1.江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室,江苏海洋大学,江苏连云港 222005; 2.江苏省海洋生物技术重点实验室,江苏海洋大学,江苏连云港 222005)

类胡萝卜素(Carotenoids)是一类天然的脂溶性色素的总称,在自然界中分布广泛,普遍存在于高等植物、微生物、藻类及少数动物之中[1-3],是一类由异戊二烯构成的萜类化合物,其基本单位是异戊二烯单位,主要由8个异戊二烯单位首尾相连形成[4]。

植物是类胡萝卜素的天然合成器,类胡萝卜素主要存在于高等植物的叶绿体中[5],是光合系统的重要组成部分之一。类胡萝卜素可作为光合作用的辅助色素,保护叶绿素分子在光照条件下不被光氧化而破坏,清除光合作用中产生的氧自由基使膜脂和膜蛋白免受破坏、以及稳定类囊体[6-7],赋予了植物叶、花朵和果实鲜艳色彩,吸引昆虫和鸟类为其传播花粉和种子,是光合天线和反应中心复合体不可缺少的结构成分[8-9]。

大多数动物不能自动合成类胡萝卜素,必须通过摄入植物体食物来提供动物体内所需的类胡萝卜素。类胡萝卜素在动物机体内具有改善免疫系统、抑制及预防癌症、延缓衰老、改善肝脏损伤,同时又是一种营养性强抗氧化剂,可促进细胞缝隙间联接交流,可有效抑制一些慢性疾病的发生[7-8,10-11]。

微藻(Microalgae)是藻类的一种,是一类需要用显微镜才能观察到的微小又能进行光合自养的群体藻类[12],以单细胞型存在于自然界中,因其富含类胡萝卜素、维生素、类固醇、蛋白质、多糖、碳水化合物和脂肪酸等生物活性化合物[13],而被广泛用于食品、药品、化妆品等多种行业[14-16],甚至应用于环境治理[17]。又因微藻生长速度快、适应性强、生长不受季节影响,因此越来越多的人们选择微藻作为提取类胡萝卜素的主要原料。于是与类胡萝卜素产量戚戚相关的代谢途径相关研究也就越来越受到人们的青睐[18]。本文就微藻中类胡萝卜素的分类、分布及特点,类胡萝卜素生物合成代谢途径和其过程中的相关基因以及基因克隆现状进行了阐述,为微藻类胡萝卜素代谢途径以及以微藻为类胡萝卜素生物合成器的深化研究提供参考资料。

1 类胡萝卜素的分类、分布及特点

1.1 类胡萝卜素的分类

目前发现的天然类胡萝卜素已达750多种[3],种类随其分类依据不同而不同。以其代谢途径,可将类胡萝卜素可以区分为初级类胡萝卜素和次级类胡萝卜素两大类[19-20];以其是否含氧原子,可分为不含氧原子的烃类胡萝卜素[21]和含有氧原子的含氧衍生物,前者只含有碳、氢两种元素,主要有β-胡萝卜素、番茄红素等,后者含有碳、氢、氧三种元素如叶黄素、玉米黄素等[22];以其结构中端环的存在与否,又可被分为环状或非环状类胡萝卜素[2];以其碳原子的数量,则可分为C30、C40、C45、C50类胡萝卜素[2]等。

同时,类胡萝卜素包括四个亚族:一是胡萝卜素,如α-、β-、γ-胡萝卜素、番茄红素;二是胡萝卜醇,如叶黄素、玉米黄素、虾青素;三是胡萝卜醇的酯类,如β-阿朴-8′-胡萝卜酸酯;四是胡萝卜酸,如藏红素、胭脂树橙[23]。

1.2 类胡萝卜素在微藻中的分布及特点

很多藻类可合成类型各异的类胡萝卜素[5],其中微藻包括蓝藻门、绿藻门、裸藻门、金藻门、甲藻门、隐藻门、黄藻门、硅藻门等九个门,其不同门含有不同的类胡萝卜素,主要包括β-胡萝卜素、叶黄素和虾青素等[24],详见表1。不同门的微藻所含的类胡萝卜素种类见表2。

表2 不同微藻中所含的类胡萝卜素Table 2 Carotenoids in different microalgae

表1 藻类所含的类胡萝卜素种类Table 1 The carotenoid species in algae

纵观类类胡萝卜素合成代谢途径,番茄红素(Lycopene)是类胡萝卜素合成途径中的一个重要的中间物质,该物质在不同酶的作用下,生成不同的类胡萝卜素,其中一个分支最终产物为叶黄素(Lutein),另一分支生成β-胡萝卜素(β-Carotene)后在不同酶的作用下最终生成虾青素(Astaxanthin)和新黄质(Neoxanthin)。在查阅大量文献后发现微藻中新黄质含量较少,因此本文着重介绍番茄红素、叶黄素、β-胡萝卜素和虾青素四种主要类胡萝卜素。

1.2.1 番茄红素 番茄红素(Lycopene)的化学式为C40H56,能够清除自由基,具有延缓衰老的作用。番茄红素能够增强细胞间隙连接,通过控制细胞增长和分化来抑制肿瘤细胞的增长,具有很好的抗癌效果[41]。番茄红素具有修复DNA损伤、预防癌症、预防心血管疾病[42-43]。

1.2.3β-胡萝卜素β-胡萝卜素(β-Carotene)的化学式为C40H56,是人类和动物合成维生素A至关重要的前体物质,也是一种抗氧化剂[49-51],β-胡萝卜素有抑制和防止肿瘤的作用,还能控制胆固醇,减少心血管疾病的发生[52-53]。

1.2.4 虾青素 虾青素(Astaxanthin)的化学式是C40H52O4,是微藻合成的第二个重要的类胡萝卜素,这种色素是由雨红球藻产生的酮类胡萝卜素[15,54]。具有超强的抗氧化活性,对于人体对抗炎症、免疫调节、抗癌有一定的帮助[24],是维生素类防氧化药物的维生素E的100倍,被誉为“超级维生素E”[55]。虾青素可防止生物膜上不饱和脂肪酸被氧化损伤,能中和生物体内因特殊物质、能量的代谢所产生的超氧阴离子、羟基自由基和单线态氧,并清除细胞内活性氧,因而具有增强生物体免疫功能、抗击肿瘤发生、防止肌肤衰老[56]等多种作用。但是虾青素与其他已知的类胡萝卜素有所不同,其不作为维生素A的前体[57]。以上四种类胡萝卜素的化学式及结构式见表3[58]。

表3 类胡萝卜素化学式及结构式Table 3 Chemical formula and structural formula of carotenoids mentioned above

2 类胡萝卜素合成代谢途径

2.1 类胡萝卜素生物合成的基本途径

因为类胡萝卜素的研究始于植物,因此其代谢途径需从源头说起。20世纪50年代,Porter等[59]发现从杂交番茄中提取出的类胡萝卜素比普通番茄多,并开始阐述类胡萝卜素的生物合成机理。总结发现,在类胡萝卜素合成代谢途径中,合成类胡萝卜素前体物质可归纳为两种模式:一种是在细胞质和内质网上进行反应的甲羟戊酸(Mevalonic acid,MVA)途径(图1左虚线框内);另一种就是在细胞原生质体中发生反应的甲基赤藓糖醇(Methyl erythritol phosphate,MEP)途径(图1右实线框内)[60]。这两种途径都产生类胡萝卜素合成的重要前体物质异戊二烯焦磷酸(IPP)及二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP),然后在不同的酶催化下合成不同类型的类胡萝卜素。通常情况下,哺乳动物和酵母采用MVA途径,即由乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)开始,生成甲羟戊酸,再生成IPP[61],而所有的高等植物、一部分细菌和一些绿藻细胞中,大多是通过MEP途径[62],即由3-磷酸甘油醛(GA-3-P)和丙酮酸(Pyruvate)经过一系列酶生成IPP。微藻中的类胡萝卜素是采用MEP代谢途径合成类胡萝卜素前体物质IPP的[63-65]。

图1 类胡萝卜素生物合成途径Fig.1 Biosynthesis of carotenoids注:*表示类胡萝卜素合成途径中已经克隆基因的酶。

由图1可见,类胡萝卜素合成过程中的关键步骤是从合成IPP开始,IPP在IPPI基因(Idi)作用下生成DMAPP,DMAPP在Idi作用下又合成IPP,此时3分子IPP和1分子DMAPP共同在GPS基因(CrtE)调控下生成GPP;随后GPP通过两个步骤合成中间产物GGPP,首先GPP在FPS催化作用下合成FPP,FPP又在GGPS基因(CrtE)作用下生成GGPP,此后2分子GGPP在PSY基因(CrtB)的调控下缩合成第一个类胡萝卜素Phytoene[66];Phytoene经过PDS基因(CrtP)、Z-ISO基因(CrtH)、ZDS基因(CrtQ)和CrtISO基因4个调控过程后生成Lycopene;Lycopene在LYCE基因(CrtL-e)和LYCB基因(CrtL-b)作用下分别生成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素[67-68],最后再生成其他类胡萝卜素;在β-胡萝卜素在BKT基因(CrtO)调控下合成Astaxanthin[69]。

MVA途径合成物质:Acetyl-CoA:乙酰辅酶A;Acetoacetyl-CoA:乙酰乙酰辅酶A;HMG-CoA:3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA;MVA:甲羟戊酸;MVP:甲羟戊酸-5-磷酸;MVPP:甲羟戊酸-5-二磷酸。所需的酶:AACT:乙酰辅酶A乙酰基转移酶;HMGS:HMG-CoA合成酶;HMGR:HMG-CoA还原酶;MVK:甲羟戊酸激酶;PMVK:甲羟戊酸磷酸激酶。

MEP途径合成物质:Pyruvate:丙酮酸;G3P:3-磷酸甘油醛;1-DX-5P:1-脱氧木酮糖-5-磷酸;2C-MEP-4P:2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸;CDP-ME:二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖;CDP-MEP:4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸;MEP-CPP:2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸;HMBPP:E-4-羟基3-甲丁-2-烯基二磷酸。所需的酶:DXS:1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶;DXR:1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶;MCT:2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷转移酶;MCK:2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-胞苷二磷酸激酶;MCS:2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶;HDS:1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-磷酸合酶;IDS:IPP/DMAPP合酶。

两种途径相同的合成物质:IPP:异戊二烯焦磷酸;DMAPP:二甲基丙烯焦磷酸;GPP:牻牛儿基焦磷酸;FPP:法尼基焦磷酸;GGPP:牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸;Phytoene:八氢番茄红素;Phytofluene:六氢番茄红素;ζ-carotene:ζ-胡萝卜素;Neurosporene:链孢红素;Lycopene:番茄红素;δ-Carotene:δ-胡萝卜素;α-Carotene:α-胡萝卜素;Lutein:叶黄素;γ-Carotene:γ-胡萝卜素;β-Carotene:β-胡萝卜素;β-cryptoxanthin:β-隐黄质;Zeaxanthin:玉米黄质;Antheraxanthin:花药黄质;Violaxanthin:紫黄素或堇菜黄质;Neoxanthin:新黄质;Echinenone:海胆酮;Canthaxanthin:角黄素;Astaxanthin:虾青素。所需的酶:IPPI:IPP异构酶;GPS:牻牛儿基二磷酸合成酶;FPS:FPP合成酶;GGPS:牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶;PSY:八氢番茄红素合成酶;PDS:八氢番茄红素脱氢酶;Z-ISO:ζ-胡萝卜素异构酶;ZDS:ζ-胡萝卜素脱氢酶;CRTISO:类胡萝卜素异构酶;LYCE:番茄红素ε-环化酶;LYCB:番茄红素β-环化酶;CHY:β-胡萝卜素羟化酶;ECH:ε-环羟化酶;BCH:β-环羟化酶;ZEP:玉米黄质环氧化酶;VDE:堇菜黄质脱环氧化酶;NXS:新黄质合成酶;BKT:β-胡萝卜素酮酶。

2.2 参与类胡萝卜素生物代谢合成的相关基因及基因克隆现状

类胡萝卜素生物合成基因首次由Armstrong等从荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)中克隆[5],相继有学者阐明了类胡萝卜素合成途径相关酶大多由单个基因编码[3],涉及类胡萝卜素生物合成途径的早期反应即从IPP到Lycopene的主要基因有7个,分别为八氢番茄红素合成酶基因(CrtB),八氢番茄红素脱氢酶基因(CrtI)[70],ζ-胡萝卜素异构酶基因(Z-ISO),ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(CrtQ),胡萝卜素异构酶基因(CrtISO),番茄红素β-环化酶基因(CrtL-b),番茄红素ε-环化酶基因(CrtL-e)[7,71]。大量研究资料显示,蓝藻和绿藻只进行MEP途径[72],其中1-脱氧木糖醇-5-磷酸合酶(DXS)和1-脱氧木糖醇-5-磷酸还原异构酶(DXR)是MEP途径中最为关键的2个代谢酶[73],合成的第一个类胡萝卜素是八氢番茄红素(Phytoene)[74],并且八氢番茄红素合成酶(PSY)基因是类胡萝卜素合成途径中的关键基因[74-75]。Steinbrenner等[76]对PDS基因进行突变,提高了雨生红球藻中虾青素含量。Qi等[77]对类胡萝卜素生物合成和降解过程中涉及的9个基因的表达进行了6个发育阶段的监测,发现除叶黄素外的其他类胡萝卜素含量均增加。

资料显示,目前有150多个参与合成类胡萝卜素的基因从植物、藻类、细菌和真菌中被克隆,编码20多种不同的酶[78-82]。顾青等[83]和Jim等[72]介绍了被克隆的类胡萝卜素合成酶种类,归纳如表4。

表4 参与类胡萝卜素合成的酶Table 4 Enzymes involved in carotenoid synthesis

在类胡萝卜素合成代谢途径中,参与其催化作用的主要酶且目前研究较多的已被克隆的酶有合成酶、异构酶、脱氢酶、环化酶、羟化酶、酮酶等。

2.2.1 合成酶 参与类胡萝卜素合成的重要的合成酶有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)和八氢番茄红素合成酶(PSY)。法尼基焦磷酸(FPP)经过GGPS催化后形成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP),GGPP是合成类胡萝卜素的前体物质[84];而后PSY催化GGPP合成八氢番茄红素(Phytoene),八氢番茄红素是第一个类胡萝卜素[74]。GGPS的表达量与类胡萝卜素积累之间存在正相关关系,上调GGPS能够促进类胡萝卜素的积累[85]。PSY是第一个关键限速酶,是决定碳源对类胡萝卜素通量的调控点[86-87],其基因CrtB是类胡萝卜素合成途径中重要的目的基因[88-90],有研究对普通小球藻中PSY基因进行克隆,表明其有利于提高类胡萝卜素产量[91],更多研究发现PSY的过度表达能够增加β-胡萝卜素的含量[92-93]。Cordero等[94]将绿藻中的PSY基因转入莱茵衣藻,重组藻株中紫黄质和叶黄素分别提高了2倍和2.2倍。

2.2.2 脱氢酶 八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是类胡萝卜素合成过程中重要的去饱和限速酶[67]。Lagarde等[95]用酵母PDS基因CrtP转化集球藻(Synehococcus),叶黄素和玉米黄质均增加了50%;Liu等[96]将莱茵衣藻中PDS基因进行修饰,其类胡萝卜素含量增加,在小球藻中表达PDS基因,其类胡萝卜素含量也增加[97]。

2.2.3 异构酶 类胡萝卜素合成途径中重要的异构酶包括异戊二烯焦磷酸异构酶(IPPI)和胡萝卜素异构酶(CRTISO)。IPP和DMAPP在IPPI的催化作用下可相互转换,而后IPP和DMAPP共同作用合成牻牛儿基焦磷酸(GPP)。CRTISO又包括ζ-胡萝卜素异构酶(Z-ISO),Z-ISO异构化六氢番茄红素(Phytofluene)生成ζ-胡萝卜素,而后生成的链孢红素(Neurosporene),其在CRTISO催化作用下生成番茄红素(Lycopene)。Fang等[98]研究发现CRTISO突变会导致叶黄素含量显著降低;Wang等[71]研究发现,在类胡萝卜素合成途径中Z-ISO的缺失并没有导致类胡萝卜素合成的中断。Lagarde等[95]用酵母的IPPI基因Idi转化集球藻,类胡萝卜素含量不受影响。

2.2.4 环化酶 番茄红素环化酶(LYC)也是类胡萝卜素生物合成关键酶之一,分为番茄红素β-环化酶基因(CrtL-b)和番茄红素ε-环化酶基因(CrtL-e)[84]。番茄红素在两种不同酶的作用下生成不同的类胡萝卜素,一条途径连续经过两次LYCB催化后合成β-胡萝卜素;另一条途径则先经过LYCE催化后再由LYCB催化得到α-胡萝卜素。LYCB基因CrtL-b能够增加β-胡萝卜素和总类胡萝卜素[99]。Ye等[100]已经克隆和测序了杜氏盐藻中的LYC;Wisutiamonkul等[101]发现LCYB基因的表达水平能够控制β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的积累;抑制LYCE能增加β-胡萝卜素的积累[102-104]。

2.2.5 酮酶和羟化酶β-胡萝卜素酮酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CHY)是合成虾青素的两个关键酶[105],β-胡萝卜素经过BKT两步催化后先得到角黄素(Canthaxanthin),随后在CHY调控下最终形成次级类胡萝卜素——虾青素。CHY包括β-环羟化酶(BCH)和ε-环羟化酶(ECH)。Zhong等[106]发现单独将莱茵衣藻的BKT基因转入植物中时,虾青素的产量并不高,当BKT基因来源于不同的藻类时,β-胡萝卜素转化为角黄素,玉米黄质转化为虾青素,使类胡萝卜素含量增加;Mann等[107]将雨生红球藻的BKT基因CrtO转入到烟草中,促使β-胡萝卜素合成虾青素;周洋洋等[105]将衣藻β-胡萝卜素加酮酶基因CrBKT载入授粉5天的南瓜中,发现南瓜中类胡萝卜素的含量增加了1/3;尹航等[31]诱导绿色杜氏藻中CHY基因的表达,其叶黄素和玉米黄素含量分别是原来的2.95倍和2.33倍;Chang等[82]将藻类β-胡萝卜素羟化酶基因整合到酵母中,设计的类胡萝卜素生物合成途径可提高酵母中类胡萝卜素的产量;Lagarde等[95]用酵母的CHY基因CrtR转化集球藻,玉米黄质含量较原来增加了2.5倍。

3 展望

综上所述,20世纪50年代,人们就开始阐述类胡萝卜素的生物合成代谢机理,并克隆了参与类胡萝卜素合成途径的大部分酶,为进一步提高类胡萝卜素的产量和质量,建议加强以下几个方面的相关工作。

微藻克隆合成IPP前参与类胡萝卜素生物代谢合成的相关基因,如前文所述,在MEP途径中,合成IPP之前所参与的酶如:DXS、DXR、MCT、MCK、MCS、HDS、IDS等酶的研究较少,且克隆的合成类胡萝卜素相关酶的基因还未克隆。因此,在合成IPP前,参与类胡萝卜素生物代谢合成的相关基因克隆,或成为未来类胡萝卜素代谢基因工程的研究方向。

在类胡萝卜素生物代谢合成β-胡萝卜素后,合成虾青素的分支参与的酶已被克隆,但β-胡萝卜素在CHY催化作用下合成玉米黄质后,继续合成新黄质的途径中所参与的酶ZEP、VDE、NXS的相关基因还未被克隆。因此克隆后期合成新黄质阶段所参与的酶的基因,对合成类胡萝卜素及代谢途径的研究有一定的意义。

由于微藻的生长周期短、易于培养,且富含类胡萝卜素,因此以微藻作为生物反应器开展类胡萝卜素代谢途径的研究可节约大量时间,并且类胡萝卜素含量变化也易于检测。但是由于微藻需在显微镜下才能观察到,所以克隆其基因时可能会出现不易观察,因此在克隆时可采用标记基因的方法,在成功克隆后以利于观察。