人工贵腐玫瑰蜜葡萄酒的酿造及香气成分分析

,+,2,*

(1.云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心,云南昆明 650201; 2.云南省滇台特色农业产业化工程研究中心,云南昆明 650201)

酿酒葡萄在接近成熟期时感染灰葡萄孢可发生贵腐作用,以贵腐葡萄为原料可酿制贵腐葡萄酒,贵腐葡萄酒(Botrytized wines)因其独特的风味而具有较高的产品附加值。世界知名的自然贵腐葡萄酒有匈牙利托卡伊(Tokaji)产区的奥苏(Aszú),法国波尔多(Bordeaux)产区的苏玳(Sauternes)等[1],其中匈牙利是贵腐葡萄酒的起源地[2-3]。贵腐作用对葡萄酒风味物质的影响比较复杂,它们的风味通常有一个非常突出的变化过程,在年轻的酒中贡献主要是柑橘和干果风味,陈酿的酒则呈现出橘皮的风味[4]。灰葡萄孢(B.cinerea)的活性使得经过贵腐作用的浆果成分发生变化,比如果皮细胞退化,葡萄糖的氧化降解,甘油的产生,葡萄糖酸、半乳糖醛酸等物质含量增加,酒石酸含量降低,贵腐香气形成等[5-6]。

酿酒葡萄感染灰葡萄孢的气候条件一般为20 ℃左右的温度,75%以上的相对湿度[5],自然条件下一般表现为早晨多雾潮湿,下午阳光灿烂,但这种条件很难持续,即便是世界上著名的葡萄酒产区也只有个别年份会发生,例如法国的苏玳产区(Sauternes)、匈牙利的托卡伊(Tokaji)以及德国的莱茵产区等。由于在自然情况下很难得到满足贵腐酒生产的葡萄,所以人们开始研究人工接种贵腐菌来酿造贵腐酒。Tosi等[7]将灰葡萄孢菌的孢子悬浮液喷洒到新采摘的葡萄表面,探究人工接种贵腐菌对葡萄酒风味的影响,结果表明灰霉病菌对葡萄的侵染程度以及葡萄的萎焉程度对葡萄酒的挥发成分影响很大。Negri等[8]研究了在葡萄采摘后诱导贵腐菌侵染是否可以提高葡萄酒的品质,所得结论为侵染贵腐菌和未侵染的葡萄浆果具有显著的代谢差异,贵腐菌影响了葡萄浆果的代谢和组成。金其荣等[5,9]探究了人工贵腐菌的分离与接种方法以及人工贵腐酒的酿造工艺;陶永胜等[10]研究了酿酒葡萄经人工侵染灰葡萄孢后所酿贵腐酒的香气特征;兰圆圆[11]对人工贵腐酒的酿造工艺进行了研究。

云南省具有地理气候适宜和生物资源多样性条件,作为一个传统的葡萄酒产区,也鲜有适合贵腐酒酿造条件的葡萄园,且关于贵腐酒的生产酿造也未见有报道。本研究从感染灰霉病的夏黑葡萄果实上分离灰葡萄孢,以人工喷洒灰葡萄孢子接种的玫瑰蜜葡萄为原料酿造人工贵腐葡萄酒,并以未接种灰葡萄孢的葡萄酒为对照,通过香气成分和香气特征的比较分析,评价人工贵腐玫瑰蜜葡萄酒的香气特征及其工艺技术的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒葡萄原料 选取种植于云南农业大学现代农业教育科研基地的酿酒葡萄品种玫瑰蜜,采摘成熟的葡萄果实进行酿酒试验;贵腐菌株 为灰葡萄孢菌株,该菌株于2017从云南农业大学现代农业教育科研基地葡萄种植园的夏黑葡萄果实染病组织上分离得到,经形态学和分子鉴定为灰葡萄孢(Botrytiscinerea)[12];2-辛醇、液体石蜡、碘、酒石酸、氢氧化钠、碘化钾、淀粉、无水乙醇、硫酸、磷酸二氢钾、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、盐酸、酚酞 均为分析纯,成都科龙试剂厂;酿酒酵母(帝伯仕酿酒酵母RC212) 帝伯士啤酒有限公司;真菌基因组DNA快速抽提试剂盒 Sigma,美国;扩增rDNA-ITS 的通用引物:ITS1(AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG);ITS4(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) 由Takara公司合成;PDA培养基:200 g土豆,20 g葡萄糖,15 g琼脂,1000 mL水;BC培养基(1/2PDA培养基+1/2MEA培养基);50%土豆汁、1% 葡萄糖、2% 琼脂粉 北京索莱宝科技有限公司;0.3%大豆蛋白胨、3%麦芽汁膏、2%琼脂 均为北京凯瑞基生物科技有限公司;所用无机溶剂和有机溶剂 均为国产分析纯。

布鲁克气相色谱仪(型号SCION SQ 456-GC) 美国布鲁克公司;DB-WAX色谱柱 上海熹垣生物科技有限公司,30 m×0.25 mm×0.25 μm;75 μm CAR/PDMS萃取头 广州海恩医疗科技有限公司;光学显微镜 上海连桥生物科技有限公司;紫外分光光度计 日本Shimadzu 公司;人工气候箱(Blue pard) 诺丁科学器材有限公司;pHMT-1型pH计 瑞士梅特勒仪器公司;AUY 200分析天平 精确度万分之一,日本岛津公司;SX-500 高压灭菌锅 日本TOMY公司;SW-CJ-2FD型超净工作台 中国苏州安泰空气技术有限公司;其他均为实验室常用仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 灰葡萄孢的分离、纯化及保存 运用常规组织分离法,选取感染灰霉病的葡萄果实,先用自来水冲洗干净,再用0.1%的升汞对其表面消毒1 min,然后用无菌水冲洗2～3次,再用灭过菌的手术刀切取约2 mm×4 mm大小的病健交接组织,用灭菌的镊子夹取剪好的组织置于PDA培养基上,轻轻按压,于22 ℃下培养3～4 d,挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落,转皿纯化,多次纯化后于-4 ℃环境下保存。

1.2.2 灰霉菌形态学观察 将纯化好的灰葡萄孢接种在产孢培养基[5](BC)上,于20 ℃下培养[5]10 d左右,待其产孢后,在光学显微镜下观察分生孢子梗和分生孢子的形态特征,并做好拍照记录。

1.2.3 灰葡萄孢的分子生物学鉴定 将纯化培养的霉菌菌丝刮取下来,用液氮研磨成粉末然后采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取灰葡萄孢DNA,扩增rDNA-ITS使用通用引物:ITS1(AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG);ITS4(TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC)。

PCR扩增反应体系为50 μL,包括双链总DNA模板2 μL,上下游引物各2 μL,Master Mix25 μL,最后添加ddH2O定容至50 μL。反应条件:94 ℃热变性2 min后,以94 ℃变性30 s、37 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min作35个循环,再72 ℃延伸10 min。经2%琼脂糖(含 1 μg/mL溴化乙锭)电泳后,在紫外灯下观察结果,扩增所得片段长度约520 bp,将得到的PCR产物纯化后送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序,测序完成后将测序结果在Genbank上进行比对。

1.2.4 菌悬液的配制 将灰葡萄孢接种至产孢培养基上,在培养温度为22 ℃,相对湿度为75%的条件下培养10 d左右,待其产孢后,将培养好的灰葡萄孢菌丝和孢子刮下,将其溶于100 mg/L 的生理盐水中,制成孢子数约为1×106个/mL的孢子悬浮液。

1.2.5 葡萄酒酿造实验 人工贵腐葡萄原料的制作及酒样酿造:预先对人工气候箱进行酒精和紫外线消毒处理,然后调至温度22 ℃,相对湿度85%,将新鲜采摘的约10 kg玫瑰蜜葡萄果实悬挂于气候箱内,配制500 mL的孢子悬浮液,采用人工喷雾,非伤口接种的方法,于早上和晚上分别喷洒葡萄的表面,连续5 d重复操作,待果实表面产生一层薄薄的灰色霉层,即可将染病的葡萄浆果置于室外暴晒风干两天左右,贵腐浆果发生皱缩,在这个过程中人工初步粒选已被灰葡萄孢侵染及表面附有菌丝的葡萄果实用于酒样酿造。将制作好的贵腐葡萄果实5 kg人工快速除梗破碎,收集葡萄汁,放入5 L广口玻璃瓶中,人工添加葡萄糖至总糖含量为320 g/L,添加50 mg/L的SO2,于4 ℃下放置24 h。待温度上升为18 ℃左右的时候,按照0.2 g/L的量接种酿酒酵母,发酵温度控制在22 ℃,当酒精度上升为13%vol左右时,添加60 mg/L的SO2终止发酵,然后将贵腐酒放置于4 ℃下静置澄清,一个月后转罐分离上清液,得到贵腐葡萄原酒,实验两次重复。

用未被贵腐菌感染的玫瑰蜜葡萄作对照样,按照和上述相同的工艺进行酿造。

1.2.6 葡萄酒常规理化指标分析 还原糖用菲林试剂法测定;总酸用NaOH滴定法测定;酒精度用比重瓶法测定;干浸出物用比重瓶称量法测定;挥发酸用双沸式蒸馏法测定;游离SO2、总SO2用直接碘量法测定;pH用pH计测定。以上测定方法均按照GB 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的标准进行测定。

1.2.7 葡萄酒香气成分分析 本研究香气成分萃取采用固相微萃取法[13],DB-WAX色谱柱,30 m×0.25 m×0.25 μm;取8 mL样品置于布鲁克气相色谱仪SCION SQ 456-GC 20 mL顶空瓶中,加入20 μL 100 μg/mL的2-辛醇作内标,将老化后的75 μm CAR/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分,于45 ℃吸附30 min,吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口,于250 ℃解吸3 min,同时启动仪器采集数据,进行气相色谱-质谱分析。质谱结果经WILEY8.0和NIST2014质谱库检索,仅当匹配度大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以报道。采用峰面积归一化法定量计算出各挥发性成分在葡萄酒中的相对含量。

GC-MS分析条件[14]为载气He,流速为1 mL/min。升温程序为以40 ℃保持3 min,然后以4 ℃/min升至160 ℃,再以7 ℃/min升至 230 ℃,保持8 min。样品注射体积为1 μL,不分流进样。连接杆温度230 ℃;进样口温度250 ℃。离子源温度:230 ℃,电子源电压70 eV,灯丝流量0.20 mA,检测器电压350 V,扫描频率1 Hz。葡萄酒香气物质的萃取方法使用顶空固相微萃取(HS-SPME)的方法,取8 mL样品置于20 mL顶空瓶中,加入20 μL 100 μg/mL的2-辛醇作内标,将老化后的75 μm CAR/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分,于45 ℃吸附30 min,吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口,于250 ℃解吸3 min,同时启动仪器采集数据。

1.3 数据处理

本实验进行了两次平行,两次重复,所有数据均按照两次重复分析而得。分析数据及做图表使用Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 灰葡萄孢的形态学鉴定

所分离的菌株在培养初期长出白色的“绒毛”,“绒毛”范围逐渐扩大,菌落直径增大,到培养的第7 d,菌落由白色开始转变为灰色,第8 d菌丝体开始变成褐色,气生菌丝相当发达,基内菌丝集结成团,在第10 d开始产孢。在光学显微镜100倍放大下观察菌株的孢子形态(如图1),分生孢子梗呈葡萄穗状,分生孢子呈球状或椭球形,通过对比真菌分类鉴定手册上的描述特征可初步鉴定为灰葡萄孢[12](Botrytiscinerea)。

图1 菌株孢子形态Fig.1 Spore morphology of bacterial strain

2.2 灰葡萄孢的分子生物学鉴定

对初步鉴定为灰葡萄孢菌株的rDNA-ITS区序列进行测序分析。把测得的序列在GenBank上进行Blast比对,所得结果为测试菌株与已上传的灰葡萄孢(Botrytiscinerea)序列相似率均大于或等于99%,其中和菌株MF741314(提交于韩国庆北国立大学农业生命科学学院)和KY319171(提交于美国爱荷华州立大学植物病理与微生物学系)的相似率为100%,结合前面的形态鉴定,可以确定本研究所分的菌株为灰葡萄孢。

图2 Blast比对结果Fig.2 Results of Blast comparison

2.3 葡萄酒基本理化指标

人工贵腐酒酿造完毕后对其常规理化指标进行分析,包括还原糖、酒精度、游离SO2和总SO2含量、干浸出物含量、总酸、pH和挥发酸含量。传统甜红葡萄酒和人工贵腐葡萄浆果所酿酒的常规理化指标分析结果见表1。

表1 试验酒样的常规理化指标Table 1 Conventional physical and chemicalindicators of sample wines

从表1可知,人工贵腐酒的酒精度、干浸出物、游离SO2含量、总SO2含量、pH、挥发酸均比对照酒样高,总酸、还原糖比对照酒样低,但这些指标相差并不大,葡萄酒的理化性质主要受葡萄原料和酿造工艺的影响,所测结果指标均符合国家葡萄酒产品标准(GB 15037-2006)。

2.4 葡萄酒的香气成分分析

本研究采用HS-SPME和GC/MS技术分别对人工贵腐酒和对照酒样的挥发性物质进行检测,测定结果为对照酒样确定了29种挥发性成分,占总峰面积的99.51%,相对含量在0.03%～23.32%,其中有5种醇类物质,10种酯类物质,6种醛酮类物质,2种酸类物质,4种萜烯类物质和2种其他香气物质组成;人工贵腐酒确定了42种挥发性成分,占总峰面积的95.77%,相对含量在0.02%～28.76%,其中有6种醇类物质,15种酯类物质,10种醛酮类物质,3种酸类物质,5种萜烯类物质和3种其他香气物质组成,两种酒样的香气组成出现了差异,且人工贵腐酒的香气物质种类要多于对照酒样。

醇类物质是在酒精发酵过程中的主要次级代谢产物之一,它能够赋予葡萄酒典型性香味。酒精发酵过程中,酿酒酵母可以通过埃利希途径(Ehrlich pathway)将支链氨基酸合成其自身所需要的氨基酸,同时伴随着高级醇的产生[10]。相对于对照酒样,人工贵腐酒中的异丁醇、异戊醇、苯乙醇的含量较高,这些物质可以赋予葡萄酒的醇香和花香等。

在供试酒样中,酯类物质是检测到的含量最高的一种挥发性物质,酯类物质主要赋予葡萄酒的水果香和花香,人工贵腐酒样中检测到了15种酯类物质,对照酒样中检测到了10种,其中庚酸乙酯(水果香、白兰地),丁二酸二乙酯(甜香、乳香),肉桂酸乙酯(奶油、草莓、肉桂)等只在人工贵腐酒中检测到,但对照酒样酯类物质的总相对含量(68.02%)高于人工贵腐酒的(48.77%)。根据Tosi等[15]的研究,经灰霉菌感染的葡萄汁中的酯酶活性会升高,从而造成贵腐酒中酯类物质的总含量降低,这一结论和本试验的结果相符。

葡萄酒中的大部分羰基化合物(醛和酮)主要是由微生物发酵生成的,由于其香气阈值很低,所以对葡萄酒的香气影响很大[16]。在本研究中对照酒样中检测到了6种醛酮类,人工贵腐酒样中检测到了10种,且总的相对含量也要高于对照,这很可能是受灰霉菌的影响。Chehab等[17-18]的研究表明,醛类物质具有抑制真菌的作用,而人工贵腐酒中醛类物质增加是葡萄本身对灰葡萄孢侵染的应激反应产生的[10]。其中甲基庚烯酮(柑橘)、庚醛(杏仁味)为人工贵腐酒所特有,正辛醛(橘子味)、3-羟基-2-丁酮(奶油、脂肪)、癸醛(香辛料)等物质含量比对照高。

供试酒样中,检测到的酸类物质较少,其中人工贵腐酒乙酸含量较高,这可能是由于贵腐菌的侵染致使葡萄汁中挥发酸含量增高。而己酸(干酪香、腐败味),辛酸(奶油、脂肪酸)的相对含量则是对照比人工贵腐的要高。Tosi[15]等认为这是由于贵腐酒中的脂肪酸氧化作用和灰霉菌侵染引起的脂质降解活动造成的。

萜烯类化合物一般是来源于果实本身的香气。其中萜烯醇类的香茅醇(玫瑰香),里那醇(玫瑰花香、果香),4-萜烯醇(胡椒、木香)为人工贵腐酒含量高于对照,其他一些微量物质对葡萄酒香气贡献较小,但这些含量稀少,种类较多的香气物质,对葡萄酒香气总体结构的饱满性和复杂度的增加有一定的作用。

3 结论与讨论

玫瑰蜜葡萄属欧美杂交种,是一种酿酒和鲜食兼用品种,在云南地区已有几十年的栽培历史,主要分布在弥勒和香格里拉葡萄酒产区[28]。用玫瑰蜜葡萄酿制的葡萄酒,酒体丰满,呈宝石红色,并具有特殊的水果芳香味[29]。本研究通过对成熟的玫瑰蜜葡萄进行人工接种贵腐菌,酿造玫瑰蜜贵腐葡萄酒,拟对云南葡萄酒产区人工贵腐酒的生产做一些尝试。

表2 两款酒样的香气成分的HS-SPME-GC-MS测定Table 2 HS-SPME-GC-MS determination of the aroma components of simple wines

本研究在感染灰霉病的夏黑葡萄果实上分离灰葡萄孢(B.cinerea)菌株,通过形态学和分子鉴定,确定分离菌株为灰葡萄孢(B.cinerea)。然后喷洒孢子悬浮液,用非伤口接种的方法对玫瑰蜜葡萄进行人工接种,在温度为22 ℃,85%相对湿度的环境中,连续接种5 d,灰葡萄孢成功接种到玫瑰蜜葡萄上,随即将被侵染的葡萄置于室外暴晒风干2 d左右,待其皱缩呈贵腐葡萄状,人工粒选酿造贵腐葡萄酒。用HS-SPME-GC-MS分析人工贵腐酒的香气成分,通过与对照相比,人工贵腐酒一共检测到了42种香气物质,对照检测到了29种,并且具有更多种类的酯类和醛酮类化合物,使得人工贵腐玫瑰蜜葡萄酒具有更为丰富的香气特性。

关于贵腐酒的特征香气物质,由于都是用灰葡萄孢(B.cinerea)侵染过的葡萄所酿的酒,所以应该具有某些共同的香气成分。Miklósy等[30]对匈牙利贵腐葡萄酒的香气物质进行了研究,认为α-内酯和γ-内酯为贵腐葡萄酒的特征香气物质,而本研究的人工贵腐酒样也有检测到了γ-壬内酯,而在对照中未曾出现。也有研究认为,醛酮类物质的增加是贵腐酒的主要特征,陶永胜等[10]的研究认为,人工贵腐酒具有更多的醛类物质,主要是因为醛类物质具有更强的抑菌活性来应对灰葡萄孢的侵染。兰圆圆[11]在研究人工侵染的贵腐葡萄酒工艺的过程中,也发现一些羰基物质只有在经过灰霉菌处理的酒样中才能检测到,而在本研究中,同样检测到了比对照种类多且相对含量高的醛类物质,除了这些,还检测到了更多种的醇类、酯类和萜烯类化合物,这些物质增加了人工贵腐酒香气的复杂性和丰富度。综上所述,由于贵腐菌的作用,影响了葡萄酒的品质和风格,贵腐酒是贵腐菌与酿酒葡萄相互作用的结果。

通过人工接种灰葡萄孢的方式获得贵腐葡萄,酿造的人工贵腐玫瑰蜜葡萄酒具有较为丰富的香气成分和较为复杂的香气特征,并具有贵腐酒的典型性。验证了使用玫瑰蜜葡萄酿造人工贵腐酒的可行性,这使得玫瑰蜜葡萄酒的产品更加多元化,香气的探索和利用更加充分,同时为云南省酿造人工贵腐葡萄酒技术的可行性提供了参考,下一步则需要对人工贵腐酒的规模化生产技术进行探索。