麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡

胡惠清，李静，方坤，卢彩红，刘斌

（武汉市第九医院，湖北 武汉438000）

黑色素瘤（Melanoma）是一种来源于黑色素细胞或黑色素前体细胞的恶性肿瘤，常见于皮肤，但也可见于黏膜，是人类皮肤癌中恶性程度最高的肿瘤之一[1]。黑色素瘤恶性程度高，易转移，预后差[2]。PI3K/Akt/mTOR信号通路广泛参与调控细胞的增殖、凋亡和细胞周期等生理病理活动。该通路在人黑色素瘤的发生发展中扮演重要角色。因此，抑制该通路可能成为治疗黑色素瘤的有效手段[3]。最近的研究表明，麦冬有效成分麦冬皂苷B对多种肿瘤细胞增殖有抑制作用[4-5]。本研究以人黑色素瘤细胞系A375为实验材料，探讨麦冬皂苷B抑制黑色素瘤细胞增殖的分子机制，观察麦冬皂苷B对A375细胞增殖，凋亡和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 麦冬皂苷B粉剂（四川省维克奇生物科技有限公司生产，批号38971-41-4），用二甲亚砜溶解，用改良杜氏伊格尔培养基（DMEM）培养基稀释，DMSO终体积分数≤0.01%；人黑色素瘤细胞A375（中国科学院细胞库）；100 U/L青霉素和100 μg/L链霉素、细胞计数试剂盒CCK-8（武汉博士德生物公司）；胎牛血清购自Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD Biosciences公司；β-actin抗体、PI3K 抗体，p-PI3K 抗体，Akt抗体，p-Akt抗体，mTOR 抗体，p-mTOR 抗体、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3、Cyclin D1 抗体购自 CST公司；2抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。化学发光检测试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取人黑色素瘤A375细胞，用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及链霉素（100 mg/L）的DMEM培养液，于37℃、5%CO2下培养，胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行试验。由健康男性包皮中提取黑色素细胞[6]，在M254培养基（含HMGS）中培养，钙离子结合蛋白S100免疫组化染色证实纯度超过95%。

1.2.2 CCK-8法检测麦冬皂苷B对正常黑色素细胞增殖的影响 将对数生长期正常黑色素细胞消化后，按5×104/孔接种于 96孔板中，培养 24 h，实验分为只含有培养基和CCK-8的空白组、终浓度分别为 0（溶剂对照组）、5、10、20、40、60 μmol/L 麦冬皂苷B组，每组6孔，培养48 h后，加入CCK-8 10 μL，待培养液显色后，用酶标仪测各孔450 nm波长的吸光度A值，以细胞的存活率表示细胞的增殖程度。细胞的存活率（%）=[（A1-A3）/（A2-A3）]×100%。A1：试验组；A2：对照组；A3：只含有培养基和CCK-8空白组。

1.2.3 CCK-8法检测麦冬皂苷B对A375细胞增殖的影响 将对数生长期A375细胞消化后于96孔板中培养 24h，实验分为 0（对照组）、5、10、20 μmol/L麦冬皂苷B组，各组培养48h后，加入CCK-810μL，待培养液显色，用酶标仪测各孔450nm波长的A值。

1.2.4 细胞凋亡的检测 取对数生长期A375细胞，按5×104/L置于细胞培养瓶内，每瓶加细胞悬液2mL，培养 24 h，实验分为 0（对照组）、5、10、20 μmol/L麦冬皂苷 B组、20 μmol/L麦冬皂苷B+20 mg/L胰岛素样生长因子（IGF）-1，孵育48 h，收集细胞，1 000转/min离心弃上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，收集细胞，在冰浴中避光进行如下操作：用试剂盒中结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为5.0×104/L，加入Annexin-FITC和PI染色液，混匀后孵育15min，于1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 流式细胞仪检测A375细胞周期变化 取对数生长期细胞，调整细胞浓度至5.0×104/L，接种于6孔板，培养24 h，实验分组同方法3，培养48 h，消化，1 000转/min离心，弃上清液，预冷PBS重悬细胞，离心洗涤3次，用体积分数为70%的乙醇4℃固定过夜。测定前用PBS洗去乙醇，加入含有核糖核酸酶RNase的0.05%PI染色液，避光染色30 min后，上流式细胞仪分析细胞脱氧核糖核酸（DNA）含量的变化。

1.2.6 免疫印迹实验 实验分组同1.2.4，细胞经不同剂量麦冬皂苷B处理24h后，进行免疫印迹分析。各组细胞经PBS洗涤2次后，用预冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，然后4℃12 000转/min离心20 min，收集上清并用BCA法定量。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，将凝胶上的蛋白质电转至硝酸纤维素膜上；再用5%脱脂奶粉封闭过夜，加入Ⅰ抗，室温孵育3 h后加入Ⅱ抗，最后化学发光液曝光显影。实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件分析，数据用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麦冬皂苷B对正常黑色素细胞增殖的影响 与对照组（麦冬皂苷B浓度0 μg/mL）比较[存活率为（99.08±0.89）%]，5、10、20 μmol/L mg/L 麦冬皂苷 B组[存活率分别为（98.67±0.59）%、（98.43±1.17）%、（98.06±1.06）%]对正常黑色素细胞存活率无明显影响（F=1.21，P＞0.05）。当麦冬皂苷B浓度为40，60 μmol/L时，比较对照组，细胞存活率显著下降（F=65.67，P＜0.01），存活率分别为（85.24±3.427）%、（75.33±5.15）%。因此选定麦冬皂苷B的工作浓度为5、10、20μmol/L 。

2.2 麦冬皂苷B对A375细胞增殖的影响 对照组（麦冬皂苷 B 浓度 0 mg/L）和 5、10、20 μmol/L 麦冬皂苷B组细胞存活率分别为（97.34±8.12）%、（69.27±6.78）%、（57.91±6.87）%、（42.70±5.54）%，随着麦冬皂苷B浓度增加，细胞存活率下降，且呈浓度依赖性，组间差异均有统计学意义（F=67.41，P＜0.01；P＜0.05）。

2.3 麦冬皂苷B抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化 免疫印迹结果显示经麦冬皂苷B处理24 h后，细胞内PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平受到明显抑制，且抑制作用呈剂量依赖性（F=40.42，P＜0.01；F=51.23，P＜0.01；F=31.82，P＜0.01）。细胞内总 PI3K，Akt，mTOR 的表达量无明显变化（F=0.72，P＜0.01；F=0.90，P＜0.01；F=0.20，P＜0.01）。但加用 20 mg/L IGF-1处理后，与20 μmol/L麦冬皂苷B组比较，A375细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路明显活化（q=4.52，P＜0.05；q=7.63，P＜0.01；q=3.11，P＜0.05），见图1。

2.4 麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导A375细胞凋亡和阻滞细胞周期AnnexinV/PI双染法结果显示，用不同浓度麦冬皂苷 B（终浓度分别为 5、10、20 μmol/L）处理 A375 细胞48 h后，细胞总凋亡率分别为（13.39±1.48）%、（24.38±2.44）%、（36.87±2.03）%，与对照组（3.87±0.56）%相比，呈明显浓度依赖性，组间差异均有统计学意义（F=386.38，P＜0.01；P＜0.05），加用 20 mg/L IGF-1处理后，细胞总凋亡率为（14.63±2.44）%，较20 μmol/L麦冬皂苷 B组明显降低（q=28.31，P＜0.01）。与对照组相比，5、10、20 μmol/L 麦冬皂苷 B组A375细胞G0/G1期细胞比例差异均有统计学意义（F=56.14，P＜0.01）。对照组细胞 G0/G1期比例低于5 μmol/L麦冬皂苷B组、5 μmol/L麦冬皂苷B组低于10 μmol/L麦冬皂苷B组、10 μmol/L麦冬皂苷B组低于20 μmol/L麦冬皂苷B组，差异有统计学意义（q 值分别为 4.10、3.97、9.45，P＜0.05）。而 IGF-1 处理抑制了麦冬皂苷B的上述效应（q=28.31，P＜0.01）。见图2。

2.5 麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对凋亡相关蛋白的影响 经Hoechst染色后，对照组中的A375细胞大而饱满，呈均匀蓝色荧光；在麦冬皂苷B处理组中细胞核可见浓染致密的颗粒荧光，细胞缩小；随麦冬皂苷B浓度的增加，细胞出现典型的凋亡形态，高倍镜下可观察到细胞变小，胞核皱缩、碎裂，染色质浓缩，聚集在核膜边缘，形成染色质边集。见图3A。

图1 麦冬皂苷B对A375细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

5、10、20μmol/L麦冬皂苷B组与对照组A375细胞Bcl-2的表达组间差异有统计学意义（F=185.155，P＜0.01），对照组高于 5 μmol/L 组、5 μmol/L 组高于10 μmol/L 组、10 μmol/L 组高于20 μmol/L组（q值分别为 6.7945、14.5883、8.5598，P＜0.05），加用 20 mg/L IGF-1处理后，A375细胞Bcl-2的表达较20 μmol/L麦冬皂苷 B 组明显降低（q=8.936 85，P＜0.01）；Bax的表达组间差异有统计学意义（F=102.508，P＜0.01），对照组低于 5 μmol/L 组、5 μmol/L 组低于 10 μmol/L组、10 μmol/L 组低于 20 μmol/L组（q值分别为5.177、10.303、7.041，P＜0.05），加用 20 mg/L IGF-1处理后，A375细胞Bax的表达较20 μmol/L麦冬皂苷B组明显降低（q=20.519 2，P＜0.01）。Cleaved-caspase3 的组间差异有统计学意义（F=131.635，P＜0.01），对照组低于 5 μmol/L 组、5 μmol/L 组低于 10 μmol/L 组、10μmol/L组低于20μmol/L组（q值分别为13.1086、3.999 8、10.654 9，P＜0.05），加用20 mg/L IGF-1 处理后，A375细胞Cleaved-caspase3的表达较20 μmol/L麦冬皂苷 B 组明显降低（q=23.078 7，P＜0.01）。见图 3B、C。

3 讨论

黑色素瘤的发病率和死亡率很高，已被证明占皮肤癌死亡例数的85%以上，在世界范围内造成严重的社会经济问题[7]。近年来，恶性黑色素瘤的发病率一直在上升，年增长率为3%～7%[8]。早期黑色素瘤可通过手术切除治愈，但转移性黑色素瘤在扩散的情况下可抵抗放疗和化疗，导致晚期患者的高死亡率。因此，有必要寻找新的治疗靶点和策略来有效阻止黑色素瘤的进展和转移。

近年来，越来越多的证据表明，多种中药及其生物活性成分有抗肿瘤作用，是一种新的肿瘤治疗策略[9]。几十年来，麦冬的药理研究一直广泛地关注其在心血管疾病防治中的作用。然而，最近的一项研究表明，麦冬皂苷B是从麦冬中分离出的一种皂苷化合物，能剂量依赖性地提高非小细胞肺癌细胞的增强细胞自噬和凋亡，阻滞细胞周期，有抗肿瘤作用[4]。此外，麦冬皂苷B还可以通过促进JNK1/2和ERK1/2途径的磷酸化来降低线粒体膜电位和增强活性氧，从而增强SGC-7901人胃癌细胞的凋亡[5]。

图2 麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导A375细胞凋亡并阻滞细胞周期。

本研究表明，麦冬皂苷B在所选浓度内处理正常人黑色素细胞对细胞的增殖无影响，而对A375细胞增殖有明显抑制作用。随着促凋亡蛋白的增加和抗凋亡蛋白的减少，麦冬皂苷B剂量依赖性地促进了A375细胞的凋亡。众所周知，Bcl-2和Bax是参与线粒体依赖性凋亡途径的2个重要调控因子，而Caspase-3作为一种关键蛋白酶在细胞凋亡的执行阶段起着关键作用[10]。在细胞凋亡过程中，凋亡前蛋白Bax在死亡信号的作用下升高，形成Bax/Bax凋亡前同二聚体，这也可以促进细胞色素C的释放和Caspase-9的活化，从而导致Caspase-3的活化[11-12]。相反，Bcl-2过表达，通过与Bax形成异二聚体发挥抗凋亡作用，可能中和Bax的促凋亡活性，抑制细胞凋亡[13-15]。此外，笔者的研究显示麦冬皂苷B通过在G0/G1阶段诱导细胞周期停止和阻止细胞进入S阶段抑制黑色素瘤细胞的生长。细胞增殖调控存在2个重要调控点即G1/S期和G2/M期，当正向调节因子积累到越过G1/S期临界点的浓度水平，细胞就会按照一定的顺序完成整个周期，所以G1/S期是细胞周期的重要节点[16]；Cyclin D1是G1/S调控点的关键因子之一[17]。麦冬皂苷B处理细胞后，Cyclin D1的表达明显下降。Chen等[18]结果表明，不同浓度的OPB能抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，并在G0/G1期引起细胞周期停滞，从而减缓NSCLC NCI-H157和NCI-H460细胞的生长，与本文研究结果相似。

图3 麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路调节A375细胞凋亡相关蛋白的表达

PI3K/Akt/mTOR信号通路广泛存在于细胞中，在细胞周期和凋亡中扮演重要角色。研究发现，PI3K/Akt/mTOR信号途径在人黑色素瘤中过度活化，提示该通路与人黑色素瘤的发生发展关系密切[3]，mTOR活化并磷酸化4E-BP1，参与形成eIF4F复合物，启动翻译并编码细胞周期调节蛋白[19]。本研究发现麦冬皂苷B可抑制A375细胞中PI3K、Akt、mTOR的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化，促进人黑色素瘤细胞凋亡，阻滞了细胞周期。当采用PI3K/Akt/mTOR通路激活剂IGF-1处理细胞后，麦冬皂苷B的上述作用被明显抑制。

总之，麦冬皂苷B能够诱导促进人黑色素瘤细胞凋亡，阻滞了细胞周期，抑制细胞增殖，本研究为人黑色素瘤的临床辅助治疗提供了新的策略。