饵料中添加有益微生物对日本医蛭生长和成活的影响

刘飞 ，甘奇超 ，袁渊 ，王伟 ，安小平 ，沈财祥 ，付宪冬

（1.重庆多普泰制药股份有限公司，重庆 万盛 400800；2.重庆铭实农业科技开发有限公司，重庆 万盛 400800）

水蛭作为一种传统中药，具有破血、通经、逐瘀的功效，最早见于《神农本草经》[1]，近年来临床研究表明，水蛭还具有抗血栓[2]、抗炎症[3]、抗肿瘤[4]、抗动脉粥样硬化[5]等作用。日本医蛭（Hirudo nipponica Whitman,1886）属于环节动物门，医蛭科，医蛭属[6]，别名水蛭，稻田医蛭[7]。是目前《中国药典》唯一收录的以动物血液为食物来源的水蛭药材种类，其体内所含有的水蛭素，是一种极强的天然抗凝血酶类物质，其凝血酶的抑制作用是人工重组水蛭素的10倍，且没有人工重组水蛭素的出血等副作用[8]。

由于日本医蛭药用价值及经济价值的不断提升，人类对其胡乱抓捕现象越来越严重，再加上环境恶化导致日本医蛭野生数量逐步减少，因此日本医蛭养殖行业逐渐兴起，且养殖规模日益扩大。但在人工养殖过程中，由于饵料充足日本医蛭一次进食量过大，加上其喜攀附于箱壁，运动量很少，导致饵料长期积于体内，消化周期长，生长缓慢。并且肠道中还容易滋生有害细菌，诱发肠炎等疾病，造成日本医蛭大量吐血死亡。

有益微生物能很好的在动物肠道内定植并迅速生长繁殖成一定数量，形成优势菌，维持肠道菌群的高水平稳定，具有调节动物肠道失调，预防肠道疾病的作用。唐宝英等研究证实利用丁酸梭菌能使草鱼增重率大幅提高[9]，张彬等利用硝化细菌、光和细菌和EM菌净化菲牛蛭养殖水体，对菲牛蛭存活率有明显的提高作用[10]，但日本医蛭饵料中添加有益微生物还未见报道。

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是一种产乳酸革兰氏阳性菌，其普遍存在于人和动物肠道内，具有改善动物营养代谢，提高免疫功能，增加摄食、促生长等功能[11-13]，是我国农业部在《饲料添加剂品种目录2013》中明确规定可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是一种厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌，人和动物肠道内的正常菌群，具有调节肠道微生态平衡，增强免疫、促生长等作用[14]。该研究在日本医蛭的饵料中添加粪肠球菌和丁酸梭菌，从而检验2种肠道有益菌对日本医蛭成活率和增重率的影响，确定2种肠道有益菌的最佳投喂浓度，为日本医蛭及其他吸血类水蛭的人工养殖提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

日本医蛭采集于河北、山东地区，健康无病，每条平均体质量0.25 g，采集后的日本医蛭养殖于120 cm×60 cm×50 cm聚乙烯塑料箱中，箱底设有40目防逃网，养殖用水来自地下井水，水温20～24℃，溶氧为5.8～8.2 mg/L，pH 值为 7.1～7.3。

1.2 有益微生物的培养

两种菌种均来自广东鹤山市龙之品生物科技有限公司，粪肠球菌接种于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基，37℃条件下进行活化和扩繁培养，丁酸梭菌接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养。将所得的两种菌发酵液用生理盐水稀释，进行活菌计数，计算总菌体数量。然后4 000 r/min离心15 min，弃去上清液，以无菌生理盐水洗涤，再4 000 r/min离心15 min，弃去上清液，获得沉淀菌体。然后用无菌生理盐水稀释到确定浓度（CFU/mL），得到已知浓度的粪肠球菌和丁酸梭菌菌悬液，混合菌利用该两种菌等比例配比而成。

1.3 试验方法

用已知浓度的菌液再以新鲜猪血为基础饵料配比成不同浓度的有益微生物作为该试验的考察因素（表1），以日本医蛭的存活率、增重率做评价指标，并参照0#对照组，优选两种有益菌与日本医蛭食用饵料的最佳配比。

选取健康的日本医蛭进行分箱养殖，每箱4 000尾日本医蛭，均重在0.25 g，并设3组试验平行。将新鲜猪血和已知浓度菌液灌制到猪小肠中进行投喂，投喂饲料量按照每箱日本医蛭5L进行投喂。饲养周期为30d（2019年5月6日到2019年6月6日），投喂频率为1次/7 d，共计4次。试验养殖过程中观察日本医蛭活动状态，保持室内安静，做好遮光措施，避免强光照射，每天冲洗养殖箱，及时挑出死亡水蛭，保持养殖箱的清洁。

1.4 样品采集和数据分析

日本医蛭放入养殖箱前，称量所有日本医蛭总体质量（精确到0.01 g），计算日本医蛭个体平均质量，并且还需称量每箱医蛭的总体重量，称量前用湿润的纱布或绵柔纸巾除去医蛭表面水分和赃物。试验开始后，每次饵料投喂前后按试验分组分别统计日本医蛭的总体质量和箱内医蛭剩余条数，计算日本医蛭的体重增重率和成活率。最后按照体质量增重率和成活率确定粪肠球菌和丁酸梭菌的最佳添加浓度。

试验结果数值用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 17.0在a=0.05水平下进行统计分析，数据经方差分析后组间两两比较显著性差异。体质量增重率和成活率见公式一、二。

公式一：体质量增重率W（%）=（W2-W1）/W1×100%

公式二：成活率 S（%）=（S2-S1）/S1×100%

W1：每次投喂前日本医蛭平均个体质量（g）；W2：每次投喂7 d后日本医蛭平均个体质量（g）；S1：试验开始时日本医蛭的尾数（尾）；S2：每次投喂7 d后日本医蛭剩余尾数（尾）。

表1 微生物浓度水平表

2 结果

2.1 饵料中添加粪肠球菌和丁酸梭菌对日本医蛭成活率的影响

由表2可知，饵料中添加粪肠球菌，各组在试验期间成活率有一定差异，试验3#组成活率最高，为95.60%±2.56%，其次是2#组，为94.80%±1.94%，成活率最低的是0#组，为90.21%±2.15%。由表3可知，饵料中添加丁酸梭菌，试验2#组成活率最高，为96.10%±1.08%，其次是3#组，为94.40%±2.45%。由表4可知，饵料中添加粪肠球菌与丁酸梭菌混合菌，试验2#组成活率最高，为99.50%±0.28%，其次是1#组，为97.30%±0.82%。试验结束时3种添加方式日本医蛭成活率最高组是饵料中添加粪肠球菌和丁酸梭菌混合菌，为99.50%±0.28%，单独添加粪肠球菌和丁酸梭菌日本医蛭的最高成活率分别是95.60%±2.56%与96.10%±1.08%，两者没有统计学意义差异（P>0.05）。

表2 饵料中添加粪肠球菌日本医蛭的成活率

表3 饵料中添加丁酸梭菌日本医蛭的成活率

表4 饵料中添加粪肠球菌与丁酸梭菌混合菌日本医蛭的成活率

2.2 饵料中添加粪肠球菌和丁酸梭菌对日本医蛭体质量增长率的影响

由表5、表6、表7可知，第一次饵料投喂，试验各组日本医蛭体质量增长率明显高于后几次饵料投喂，各组在试验期间也存在明显差异，由表5可知，饵料中添加粪肠球菌，试验3#组体质量总增长率最高，为500.00%±8.62%，显著高于0#、1#、2#、4#（P<0.05），其次是 2#组，为 428.41%±8.84%，最低的是0#组，为272.12%±9.22%。由表6可知，饵料中添加丁酸梭菌，试验3#组体质量总增长率最高，为508.65%±8.22%，显著高于0#、1#、2#、4#（P<0.05），其次是4#组，为424.33%±9.98%。由表7可知，饵料中添加粪肠球菌与丁酸梭菌混合菌，试验2#组体质量总增长率最高，为 612.35%±5.88%，显著高于 0#、1#、3#、4#（P<0.05），其次是1#组，为532.66%±6.52%。试验最终3种添加方式日本医蛭体质量总增重率最高是饵料中添加粪肠球菌和丁酸梭菌混合菌，为612.35%±5.88%，显著高于其他两种添加方式（P<0.05），饵料中单独添加粪肠球菌和丁酸梭菌体质量总增重率最高分别是500.00%±8.62%，508.65%±8.22%，两者没有统计学意义差异（P>0.05）。

3 讨论

随着养殖业的迅猛发展，人工集约化程度不断加深，养殖过程中疾病爆发也越来越频繁，虽然抗生素和传统化学药物疗效显著，但多会在动物体内残留，给食品、药品带来安全隐患，长期使用还导致耐药菌滋生。微生态制剂不仅能够抑制有害细菌，调节动物肠道微生态环境，还能提高水产动物的品质和产量。据报道，纳豆芽孢杆菌能显著提高鲤鱼肠道蛋白酶和肝胰脏蛋白酶的活性[15]，芽孢杆菌能显著提高大菱鲆和斑节对虾的成活率和增重率[16-17]，微生态制剂能显著提高肉鸡的平均体质量和降低病死率[18]。但是微生态制剂在日本医蛭的养殖中报道较少，该试验选取粪肠球菌和丁酸梭菌，从而找到能降低日本医蛭死亡率和提高日本医蛭产量的最佳配比浓度。

表5 饵料中添加粪肠球菌日本医蛭的增重率

表6 饵料中添加丁酸梭菌日本医蛭的增重率

表7 饵料中添加粪肠球菌与丁酸梭菌混合菌日本医蛭的增重率

3种微生物添加方式的试验中，第一次饵料投喂后日本医蛭体重增重率都要显著高于后期饵料投喂后日本医蛭的体重增重率，表明日本医蛭在自然条件下基本是处于一个饥饿状态，同时饥饿状态时的摄食量比正常养殖状态下的摄食量要高，这跟张涛[19]2017年的研究结果一致。从表2～表7的试验结果表明，添加微生物的试验组与0组比较，日本医蛭的成活率与体质量增重率都有所提高，可能原因有以下几点：一是粪肠球菌和丁酸梭菌在日本医蛭体内能迅速繁殖成一定数量，形成优势菌，促进乳酸菌等有益菌的繁殖，抑制大肠杆菌等致病菌的增殖，维持肠道菌群的高水平稳定；二是粪肠球菌和丁酸梭菌能刺激日本医蛭肠道黏膜免疫活性，提高日本医蛭的免疫功能，增加了其防病、抗病能力；三是粪肠球菌和丁酸梭菌在日本医蛭肠道内能产生多种维生素、氨基酸和酶类物质，这不光给宿主提供了更多的营养物质还有助于机体更好的对营养消化吸收。

从试验结果分析，粪肠球菌和丁酸梭菌混合菌对日本医蛭成活率、体质量增重率的促进作用都要优于单独添加粪肠球菌和丁酸梭菌，这与杜宣[13]2006年利用复合微生态制剂对鲤鱼消化酶活力的影响结果一致，也是复合微生态制剂要优于单一菌种的微生态制剂。主要原因可能是复合微生态制剂含有多种菌株，在日本医蛭体内产生的维生素和氨基酸含量相对较高，提供的营养较为丰富，同时复合微生态制剂对日本医蛭肠道内的蛋白酶和消化酶活性的促进作用优于单一菌种的微生态制剂，提高了日本医蛭对饵料的利用与转化，从而促进日本医蛭快速生长。

总之，在日本医蛭的人工养殖过程中适当的加入粪肠球菌和丁酸梭菌，可以降低日本医蛭的病死率，提高日本医蛭的产量，该文的研究能为日本医蛭的大规模人工养殖提供一定的科学依据。