体外培养鼠胚实验对IVF实验室质控的评估

彭 涛，刘永刚，李 琴

（云南九洲医院生殖医学科，昆明 650000）

IVF（体外受精）实验室是辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）能否顺利实施的关键环节，是产生胚胎的重要场所，直接决定患者接受辅助生殖技术后的结局。近年来，虽然胚胎体外培养技术得到了长足发展，但体外培养仍然无法完全模拟体内生长环境，胚胎实验室实行严格的质量控制和质量保证体系，不但有利于构建稳定的培养环境，而且有助于分析对胚胎培养造成影响的因素。因此，在培养人类胚胎前需要检测实验室的环境以确定该实验室是否符合使用条件，检测培养箱的各参数以确定能否成功开展胚胎培养。最后使用科学的方法对实验室、仪器设备、人员操作进行综合评估。而对此综合评估的检测方法通常有体外培养鼠胚生物学实验（mouse embryo assay，MEA）和人精子体外存活实验（human spermmotility assay，HSMA）。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级昆明种小鼠购自昆明医科大学实验动物中心，动物合格证SCXK（滇）2015-0002。雌鼠：18只，6～8周龄，体质量25～28 g；雄鼠：8只，8～10周龄，体质量33～35 g。适应性喂养3～5 d后进行实验。

1.2主要药品与试剂孕马血清促性腺激素（PMSG，宁波三生生物制品公司）；人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠医药集团公司）；精子梯度分离液（Sperm Grad），洗精受精液（G-ivf plus），卵子收集液（G-mops plus），卵裂培养液（G-1 plus），囊胚培养液（G-2 plus），胚胎培养矿物油均为瑞典Vitrolife培养液系列（瑞典Vitrolife公司）。

1.3设备与耗材IVF实验室设备包括日本Nikon SMZ解剖显微镜；Nikon Ti倒置显微镜；日本Astec培养箱；美国Thermo 3111培养箱；VWR培养箱专用温度计；丹麦K-system Daul-126工作站；Epoc血气分析仪；英国G－100 CO2浓度测定仪等。培养皿、试管等耗材均为美国BD Falcon公司产品，一次性使用。

1.4方法

1.4.1 实验室及培养箱的质控 实验室白天清水擦洗墙面和地面，加热后开门，大功率抽风机通风，夜间开启层流通风，连续处理3个月〔1〕。新到培养箱使用专用消毒液擦洗后，用灭菌纯水擦洗3遍进入实验室。培养箱内水盘不加水开机设置37℃，不通气热处理1个月，此期间每日开门2次换气。1个月后水盘加水通CO2气体（纯度99.99%），设定参数。每日早晚测温度和CO2浓度，培养箱稳定后用血气分析仪检测洗精受精液、卵裂培养液、囊胚培养液的pH值。

1.4.2 人精子体外存活实验 选择20～35岁身体健康的男性患者精液，排除传染性疾病。精液标准：液化时间20～30 min，精子密度＞20×106个/mL，PR（前向移动比率）＞32%，正常形态精子＞4%〔2〕。用精子梯度分离液和洗精受精液配制成高浓度梯度（90%）、低浓度梯度（45%）离心液。采用非连续密度梯度离心法处理精子，收集处理后精子到试管中，并调整活动精子的密度至5×106个/mL。从试管中取0.5 mL处理后的精子于标准培养管中进行精子存活实验。将上述培养管置于培养箱25℃培养、对照管置于室温下培养。分别在24、48、72 h后摇匀精子悬液，移液器吸取5μL精子悬液滴在MAKLER板计数精子的活动率（100%减去观察100个方格内的不活动精子占总精子数的百分率），同样方法计数3次，求精子活动率的平均值，然后计算存活指数（sperm motility index，SMI），SMI=测试管中向前活动精子比率/对照管中向前活动精子比率〔3〕。

1.4.3 鼠胚实验雌鼠促排卵 小鼠购回后适应饲养3～5 d，选雌鼠4～5只，下午6点腹腔注射PMSG 10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10 IU/只，注射HCG 14 h后以颈椎脱臼法处死雌鼠，腹腔表面消毒，打开腹腔，分离卵巢与输卵管，将输卵管放于装有3 mL卵子收集液的预热3001培养皿中传至实验室。

1.4.4 鼠卵的采集 在体视镜下找到培养皿中的输卵管，用1 mL注射器划破输卵管壶腹部，释放卵丘冠复合体（OCCC），在卵子收集液中，用巴斯德管将OCCC移至新的培养皿中吸吹洗涤2次后放置于受精皿的液滴中待用，受精皿预先在3001培养皿中做4个80μL受精液滴覆盖培养油，于37℃、7%CO2浓度培养箱中过夜平衡。

1.4.5 鼠精的采集 小鼠购回后适应饲养3～5 d，于取鼠卵日上午9点将雄鼠以颈椎脱臼法处死，腹部表面消毒，打开腹腔，取出形似火柴的附睾，去掉脂肪，将附睾放于装有3 mL洗精受精液的预热3001培养皿中，用1 mL注射器划开附睾尾部并挤压，挤出精子团，用巴斯德管吸出精子团，放入2 mL洗精受精液中，于37℃、7%CO2浓度培养箱中培养30 min完成获能。

1.4.6 常规IVF 收集上层雾状精子悬液进行计数，上午10点按卵：精=1：1万将精子悬液加至含卵子的受精皿液滴中开始受精，6～8 h后观察受精情况。

1.4.7 卵胞浆内单精子显微注射（ICSI） 将获得的精子置于37℃、7%CO2培养箱中培养2 h后，在透明质酸酶中用巴斯德管反复吹吸OCCC脱去周围颗粒细胞，挑选减数分裂中期Ⅱ（MⅡ）卵子放入预备好的卵子收集液滴中，将活动精子置于7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）中，经尾部制动后，仅将头先吸入显微注射针内，颈部留在针口，尾部留在针外，将精子在持卵针上蹭掉颈和尾部，显微注射针内只留精子头部，用持卵针固定卵子，保持卵极体位于6点或12点位置，注射针于卵子3点位置进针，刺破卵胞膜后回吸少量胞质，然后将精子头部注入卵细胞胞质内，用巴斯德管将完成注射的卵子转入胚胎培养液滴。完成注射6～8 h后，倒置显微镜下观察受精情况（雌雄原核出现为受精的标志），并将受精卵转移至在37℃、7%CO2中平衡过的卵裂培养液滴中继续培养。

1.4.8 胚胎观察 受精后6～8 h观察：受精卵；20 h观察：2细胞胚胎形成；60～70 h观察：胚胎致密化；90 h观察：囊胚形成；5 d观察：囊胚部分与完全扩张。记录观察数据〔4〕。

2 结果

2.1实验室处理完毕后环境检测在新装修实验室VOC（挥发性有机化合物）的主要有害成分可能以甲醛为主，其次是苯系化合物，它们是室内毒性最大的VOC〔5〕。实验室通过加热排风透气后检测环境中的VOC指标，参照《洁净手术部建筑技术规范GB50333》符合使用标准，证明实验室可以使用。见表1。

表1 胚胎实验室环境检测结果

2.2培养箱中pH值检测平衡16 h洗精受精液pH值、卵裂培养液pH值、囊胚培养液pH值使用Epoc血气分析仪测定，确定培养箱设定的CO2浓度为7%（昆明海拔1 800 m）适宜培养。见表2。

表2 培养箱中培养液pH值检测结果

2.3人精子体外存活实验结果在实际计数精子活率时，由于精子密度低，常规的计数精子方法容易受偶然因素影响，所以在计数时采取的方法是：先观察并记录在MAKLER板上100个方格内的精子总数，再单独观察记录100个方格内不动精子数，最后两数相减得到活动精子数，再用活动精子数除以总精子数得出精子活率，然后计算存活指数，最后得出结果。结果培养箱中和实验室中的精子存活指数≥95%，培养箱处理合格。见表3。

表3 精子在培养箱和培养室中的活率及存活指数

2.4鼠胚实验结果共进行了4批次鼠胚实验，精卵共培养6～8 h后“拆蛋”观察雌雄原核，即受精卵。见图1。体外受精率平均80.9%，可能操作鼠精子过程中，由于鼠精子尾部较长影响精子的活力。鼠受精卵发育到2细胞阶段胚胎的平均卵裂率是97.6%，形态见图2。随后发育到致密化胚胎，最后发育成囊胚。见图3～4。囊胚的形成率平均87.1%，表明生殖实验室设备和人员操作达到正式运行标准。见表4。

图1 鼠受精卵

图2 发育到2细胞阶段鼠胚胎

图3 鼠致密化胚胎

图4 鼠囊胚

表4 体外鼠胚实验的参数

3 讨论

新建立的实验室一定严格按时序依次对VOC、温度、湿度、培养箱等实施质量控制。根据所在地气候、海拔等条件因地制宜采取实验质量控制方式。首先实验室空气质量难以控制，却是开展工作的首要条件。空气中VOC可导致受精失败或者胚胎发育延迟及降低发育潜能等，而且这种影响不易直观发现，另外还会进入培养箱造成二次影响。其次，培养箱中空气质量可受实验室内、管道供气影响。培养箱使用经过质量认证的气体纯度99.99%，外接气体滤器Coda，有效保护培养环境〔6〕。实验室的空气虽然经过高效过滤膜（HEPA）过滤，但是新HEPA在生产及包装运输中不可避免地会携带VOC，另外IVF实验室的高效层流（HEPA）设备虽然可以部分换气及过滤空气中的尘埃粒子，但是单纯的HEPA层流在正压的条件下不能有效去除室内VOC〔7-8〕。因此，每次更换HEPA前应对HEPA进行热处理，更换后由专业测试机构检测实验室悬浮粒子及空气质量，合格后继续使用。然后，每日检测实验室的温度、湿度、培养箱的CO2浓度，保证实验室处于稳定的条件下。新建实验室的培养箱设置时要根据培养液平衡后实测的pH值反推设置CO2浓度。最后，在以上稳定、适宜的工作条件下实验室开始对试剂、耗材及人员操作实施质量控制，方法是人精子存活实验和小鼠体外受精实验。

人精子存活实验已被证实是一种对生殖实验室低水平毒性敏感性检测的有效方法，对实验室单个因素的检测有效，现在大多数的生殖中心均采用人精子存活实验作为IVF实验室专一检测培养环境和常用试剂、耗材质量控制的手段。由于要连续观察72 h，在操作过程中要注意精子放置稳定及避免人为操作影响，比如滴加精子在MAKLER板前摇匀，切忌吹打混匀，否则严重影响精子活力。

小鼠体外受精技术适用于包括实验室环境、培养箱、试剂、耗材及人员操作水平等复合条件的检验。在训练新技术人员实施ICSI操作中注意，鼠精子的尾部较长，鼠精子的断尾操作和人精子制动是不同的，训练时要注意区别。体外鼠胚试验的主要判定依据为囊胚形成率和囊胚质量〔9〕。小鼠胚胎与人胚胎有几乎相同的发育经历，因此小鼠体外受精胚胎的整个操作过程可以成为人类生殖实验室的模型，而且可以磨练操作人员技术，为今后开展人类辅助生殖技术奠定良好的基础。

生殖实验室质量控制体系是系统工程，有其先后顺序及连续性，严格实施质量控制目的是为了保证实验室不出现大的波动，获得稳定的成功率。本实验室2015年体外培养鼠胚实验验证合格后于当年获得卫健委专家评审准入资格，2018年完成两千余例，临床妊娠率达到60%以上。