贵州大樱桃种质资源亲缘关系ISSR分析

彭 磊1,，包九零3，乔 光，文晓鹏

(1.贵州大学茶学院，贵阳 550025； 2.贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵阳 550025；3.遵义市第十四中学，贵州 遵义 563000)

欧洲甜樱桃(PrunusaviumL.)，又称为大樱桃，属蔷薇科李属(Prunus)樱亚属(Subgenuscerasus)落叶果树，有“春果第一枝”的美誉[1]和“黄金种植业”之称[2]。据报道，到2016年中国大樱桃栽培面积已达18万hm2，成为世界大樱桃第一生产国[2]。大樱桃喜冷凉、干燥和日照充足的环境，目前大樱桃主要在我国的山东、辽宁等地区栽培。近年来，云贵高原、浙江等高海拔地区的大樱桃产业发展迅速[3-5]，部分大樱桃品种在贵州西部地区表现出良好的生态适应性[6]。但是由于引种品种过于杂乱，部分品种亲缘关系不清或种质资源亲本不详，存在不搭配授粉树或搭配不合理的问题，造成部分大樱桃品种有花不结实现象[7]，影响了大樱桃产业的有序发展和遗传育种工作的进行。为此，拟利用ISSR分子标记技术，研究贵州栽培的23份大樱桃种质资源的遗传背景和亲缘关系，以期为贵州地方大樱桃种质鉴定、品种登记和遗传育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的23份大樱桃种质资源材料信息见表1，均采自贵州省修文县大樱桃栽培示范园。选取无病虫害的幼嫩叶片，保鲜袋封存，液氮处理后，保存于-80 ℃冰箱。

表1 大樱桃供试种质信息

编号种质名称来源1黔1贵州2黔2贵州3黔3贵州4黔4贵州5黔5贵州6New star俄罗斯7grace star加拿大8早星不详9甜心加拿大10莫莉法国11黑金不详12砂蜜豆加拿大编号种质名称来源13美早美国14红灯辽宁15考迪亚捷克16斯坦勒加拿大17斯太拉加拿大18拉宾斯加拿大19布鲁克斯美国20斯帕克里加拿大21黑珍珠重庆22艳阳加拿大23桑提娜加拿大

1.2 基因组DNA提取

每份样品取约100 mg幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，DP 320-03)提取样品DNA，操作方法参考该试剂盒说明书。采用琼脂糖凝胶电泳(1%，ω；下同)和紫外分光光度计测定其质量和浓度后，用ddH2O稀释提取的 DNA 至约 50 ng ·μL-1，-20 ℃保存备用。

1.3 ISSR-PCR分析

PCR扩增引物参照British Columbia大学公布的ISSR引物序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从100条ISSR引物中筛选出20条扩增效果和稳定性较好的引物(表2)进行PCR扩增。PCR反应体系为10μL：含有2×Taq PCP Master Mix 5.0μL， ISSR引物0.8μL(10μM)，DNA模板1.0μL(50 ng·μL-1)，ddH2O 3.2μL。PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，51.1～56.8 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35次循环；72 ℃延伸5 min，扩增结束后4 ℃保存。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测，以DL 2000(天根生化科技北京有限公司)为标准分子量对照，在Bio-Rad凝胶成像系统中拍照、保存。

表2 用于 PCR 扩增引物序列及退火温度

引物序列(5′-3′) 退火温度/℃总位点数多态性为点数多态性比率/%811(GA)8C54.05480.0815(CT)8G54.07457.1819(GT)8A52.066100.0820(GT)8C54.066100.0823(TC)8C54.07342.9825(AC)8T54.077100.0827(AC)8G53.39777.8835(AG)8YC54.08787.5836(AG)8YA54.07571.4840(GA)8YT52.78562.5844(CT)8RC56.044100.0845(CT)8RG54.088100.0848(CA)8RG56.09777.8849(GT)8YA54.03266.7851(GT)8YG56.06466.7856(AC)8YA52.77685.7857(AC)8YG56.06583.3868(GAA)651.177100.0888BDB(CA)756.86583.3889BDB(AC)756.86466.7总数132106平均54.36.65.380.3

注：Y=(C，Y) ；B=(C，G，T)；D= (A，G，T) ；R=(A，G)。

1.4 大樱桃种质MCID图谱的构建

人工绘制植物品种鉴别图(manual cultivar identification diagram,MCID)是基于DNA标记快速鉴定品种的方法[8]。本研究利用4条多态性较好的ISSR引物的特异性扩增谱带进行23份大樱桃种质的MCID图谱构建，图谱构建参考王玉娟等[8]的方法。

1.5 数据处理

PCR扩增试验重复2次，不能重复的条带统计时忽略不计。ISSR扩增产物按在相同迁移位置上有带记为“1”，无带记为“0”，全部以1、0统计建立数据库，转换为数值矩阵后，用NTSYS pc 2.10 e分析软件中的Qualitative data进行矩阵分析和SAHN Clustering计算相似系数，并按UPMGA法构建树状图，分析样品间亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 ISSR标记多态性分析

根据20条ISSR引物的标记信息对23个大樱桃种质资源进行遗传多样性分析，共扩增出132个0.24 kb～2.0 kb的标记，平均每条引物扩增出6.6个标记，其中多态性标记106个，扩增多态性比率达80.3%。

M：DL 2000 Marker；编号1～23同表1。图1 引物835对23份大樱桃种质的ISSR扩增电泳图

注：有特异性谱带的用“+”表示；无特异性谱带的用“-”表示。图2 4条ISSR引物鉴别区分23份大樱桃种质的CID示意图

从表2可看出，每条引物的扩增多态性都不相同，其中，引物827和848检测到的位点最多，为9个；引物849检测的位点最少，为3个。

2.2 大樱桃种质鉴定

利用筛选出的4条引物(引物835、811、825和836)将23份大樱桃种质逐一单独区分鉴别出来。从图1和图2可以看出，用引物835扩增的大小为1 700 bp、950 bp和750 bp的3条特异性谱带可将23份大樱桃种质分成7组，其中有特异性谱带的用“+”表示，无特异性谱带的用“-”表示。一组为1 700“-”、950“-”、750“-”13份种质；二组为1 700“+”、950“-”、750“+”2份种质；三组为1 700“-”、950“+”、750“-”2份种质；四组为1 700“-”、950“+”、750“+”1份种质；五组为1 700“+”、950“+”、750“+”2份种质；六组为1 700“-”、950“-”、750“+”1份种质；七组为1 700“+”、950“-”、750“+”2份种质。一组种质在引物835、811和825扩增下一一区分；二组种质在引物835和811扩增下一一区分；三组、四组和六组种质仅在引物835扩增下区分开来；五组种质在引物835和836扩增下一一区分；七组种质在引物835和825扩增下区分。

2.3 大樱桃种质资源的亲缘关系

供试种质的遗传相似系数为0.26～0.92，平均达0.61。其中，甜心与桑提娜的相似系数最小，为0.26；黑珍珠与布鲁克斯的相似系数最大，为0.92。根据遗传相似性系数，采用UPGMA法进行聚类分析，建立聚类分支树状图(图3)。结果表明，ISSR标记能将23份大樱桃种质资源完全区分开。在相似系数0.62处可将供试种质分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等3大类群，其中，黔1与斯坦勒、拉宾斯单独聚在第Ⅰ类群；黔2、黔4、黔5与考迪亚、grace star、砂蜜豆、美早、甜心、莫莉、黑金、早星、New star聚在第Ⅱ类群；黔3与红灯、布鲁克斯、黑珍珠、艳阳、斯太拉、桑提娜、斯帕克里聚在第Ⅲ类群。

3 讨 论

3.1 大樱桃指纹图谱的构建

樱桃遗传组分复杂，对于差异不明显的个体，只从形态学上很难识别。研究表明，ISSR分子标记能有效地构建樱桃种质的指纹图谱[9-10]。从聚类结果来看，亲本相同或遗传关系较近的大樱桃种质都聚在同一分支，如斯坦勒及其杂交后代拉宾斯都聚在第Ⅰ类群。此外，多数来源地相同的大樱桃种质都聚在同一类群，在一定程度上也反映了种质资源的地理起源特点[11]。这些研究结果说明利用ISSR 标记进行大樱桃种质鉴定研究是可行的。

图3 23份大樱桃种质的UPGMA聚类分析

前人通过DNA分子标记，绘制了葡萄[8,12]、马尾松[13]等植物的CID示意图，证明利用MCID方法能将DNA标记信息转化为实用性强的鉴别大量品种(种质)资源的有效信息，适用于大量植物资源进行快速鉴定。本研究利用4条ISSR引物扩增的特异性谱带人工绘制了23份大樱桃种质的CID示意图，为大樱桃种质鉴定和遗传育种工作的开展提供重要依据。本研究发现，利用20条ISSR引物，通过不同的引物组合，能将所有供试的大樱桃种质资源区分开，说明通过增加引物数量能区分更多材料[14-15]。

3.2 大樱桃种质资源亲缘关系

明确大樱桃种质资源的亲缘关系是种质资源创新利用、培育优良新品种的基础[9,16]。本研究中，供试种质的遗传相似系数最小为0.26、最大为0.92，说明供试样品间遗传分化较大，遗传多样性高，遗传背景复杂[17]。从ISSR标记结果来看，黔1和拉宾斯、黔2与黔4和grace star与考迪亚、黔3和红灯与布鲁克斯、黔5和砂蜜豆的遗传相似系数较高，表现出较为密切的亲缘关系，推测它们间亲本相似或相近，这为大樱桃遗传育种和授粉树搭配提供重要科学依据。

种质资源遗传关系的相似程度与资源来源地和栽培环境具有一定的相关性[18-19]。从图3可见，黔2、黔4和黔5等来源地相同的种质表现出较近的亲缘关系。但也出现黔1和黔5这2份种质偏离所属地区，与其它大樱桃品种聚为一个分支的情况，说明同一地区的种质间存在差异，这可能与种质的起源进化有关，也可能是人工选育的结果，在其他植物的研究中也出现类似情况[20]。