HPLC 法测定二益丸中阿魏酸和欧前胡素的含量

李 岩，李成明，张生萍，白贺明，姬良亮，刘兴国

（1.兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050）

二益丸是国家中药保护品种，其处方由白芷、当归等22 味中药加工制成；具调经止带，温暖子宫之效；临床用于经脉不调，行经腹痛，淤血痨症，下元虚寒，腰膝酸痛，赤白带下。二益丸收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第一册》[1]，国家药监局网站显示目前生产单位仅有兰州佛慈制药股份有限公司一家。现行标准中通过显微鉴别和丁香的薄层鉴别对药品质量进行控制，极为简单，且处方中用量较大的当归、白芷无相适应的检测项目。此外，关于二益丸的文献报道较少，刘贻珍等[2]通过薄层鉴别法对二益丸进行定性鉴别，同时采用HPLC 法测定了欧前胡素的含量，但利用高效液相色谱法同时对阿魏酸和欧前胡素进行测定尚未见报道。因此，本研究在现行标准的基础上，建立HPLC 法同时测定二益丸中当归和白芷的指标性成分阿魏酸和欧前胡素含量的方法，操作简便、结果准确，为全面控制其质量提供参考依据。

1 仪器及试药

E2695型高效液相色谱仪（美国Wters）；BSA224SCW 型万分之一天平（德国赛多利斯），MS105DU 型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒）；SBL-10DT 型超声清洗仪（宁波新芝生物科技）；超纯水机（Millipore）。

阿魏酸对照品（111773-201614，纯度：99.0%）和欧前胡素对照品（110826-201415，纯度99.1%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯（默克），冰醋酸为分析纯，水为超纯水。二益丸：规格为4g/丸；制造商为兰州佛慈制药股份有限公司；批号分别为17H5、17H6、17H7、17H8、18A1、18A2、18A3、18A4、18A5、18F9。

2 方法与结果[3-6]

2.1 色谱条件

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18 MGII 色谱柱（5μm，250×4.60mm）；流动相：以甲醇为流动相A，以0.4%醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱（见表1）；流速：1.0mL·min-1；紫外检测器检测，检测波长：313nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按阿魏酸、欧前胡素峰计均不低于4000，分离度大于1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照储备溶液的制备

分别取阿魏酸和欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每lmL 含阿魏酸0.418968mg、欧前胡素0.1216948mg 的溶液。

表1 梯度洗脱时间

2.2.2 二益丸样品溶液的制备

二益丸供试品，剪碎，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-2%冰醋酸混合溶液20ml，密塞，称重，加热回流45min，放冷，称重，用甲醇-2%冰醋酸混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液既得。

2.2.3 阴性对照溶液

按二益丸标识处方，取相应药材，适量配制缺当归、白芷药材的阴性对照样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

取对照品储备液适量，加甲醇配制成每1mL 分别含阿魏酸4.19、8.4、16.8、41.9、83.8、209.5ug 和欧前胡素6.08、12.2、24.3、60.8、121.7、243.4ug 的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。按外标两点法，以峰面积为横坐标，进样量（μg）为纵坐标，绘制标准曲线，得阿魏酸线性方程为：Y=1.725571×104X+4.611193×104，r=0.999873，线性浓度范围为4.19～209.5mg·mL-1；欧前胡素线性方程为：Y=2.049288×104X+2.183337×104，r=0.999949，线性浓度范围为6.08～243.4mg·mL-1。

2.3.2 精密度试验

精密量取每1mL 含阿魏酸16.8μg 和欧前胡素24.3μg 的混合对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6 次，计算得阿魏酸峰面积的RSD 为1.1%（n=6）、欧前胡素峰面积的RSD 为1.7%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取批号为17H5 的二益丸供试品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、4、8、12、16、24h 各进样1 次，测定峰面积，计算得阿魏酸峰面积的RSD 为1.3%（n=6）、欧前胡素峰面积的RSD 为0.9%（n=6），表明在24h 内供试品溶液的稳定性良好。

2.3.4 重复性试验

取批号为17H5 的二益丸供试品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，测得阿魏酸和欧前胡素的平均含量分别为1.3%和0.6%（n=6），表明重复性良好。

2.3.5 回收率试验

采取加样回收方法，精密称取批号为17H5 的二益丸样品（其含量分别为：阿魏酸0.0313mg/g、欧前胡素0.1294mg/g）6 份，精密加入阿魏酸对照品和欧前胡素对照品适量，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，阿魏酸和欧前胡素的平均回收率分别为93.71%、96.96%，RSD 分别为1.22%、0.92%（n=6）。结果见表2。

表2 样品测定结果（n=3）

2.4 样品测定

取10 批次二益丸供试品按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，测定结果见表3。

表3 样品测定结果（n=3）

2.5 阴性对照试验

取“2.2.3”项下制备的阴性对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进行分析，结果显示阴性对照样品中在阿魏酸和欧前胡素对照品相应位置处无干扰峰。相关HPLC 色谱图如图1 所示。

图1 HPLC 色谱图

3 讨论

二益丸现行质量标准极为简单，仅有显微鉴别和丁香的薄层鉴别，没有含量测定项目，无法有效控制其质量。本研究通过对处方中当归和白芷的前处理方法以及高效液相色谱条件的进行摸索、考察，确定了同时测定处方中当归和白芷的指标性成分阿魏酸和欧前胡素含量的检验方法。

首先，采用紫外分光光度法进行全波长扫描，阿魏酸和欧前胡素的最大吸收分别为321.0nm、300.0nm，两者混合溶液的最大吸收为306nm；采用二极管阵列检测器分别在300.0nm、310.0nm、311.0nm、312.0nm、313.0nm、314.0nm、315.0nm、316.0nm和321.0nm 处，按“2.1”项下色谱条件对阿魏酸和欧前胡素混合对照品溶液进行分析，结果表明在313.0nm 处各成分具有良好的紫外吸收，基线平稳。

本研究考察了多种提取溶剂（甲醇、不同比例的甲醇与冰醋酸溶液体系）、多种提取方法（超声、回流）及多个的提取时间（30、45、60、75、90min），通过摸索多个前处理因素对提取结果及效率的影响，最终根据实验结果确定：以甲醇-2%冰醋酸混合溶液，加热回流提取45min，提取率最高。

二益丸处方包含22 味中药材，其化学组分复杂，采用HPLC 方法对其有效成分进行含量测定时，考虑到分离度因素，故采用梯度洗脱的色谱条件，通过大量实验，不断优化，最终确定为以甲醇为流动相A，以0.4%醋酸溶液为流动相B 的梯度洗脱色谱条件。

本研究所述方法操作简单，结果可靠，适宜于二益丸的质量控制，为全面控制其质量提供参考依据。