紫外可见分光光度计测定竹荪中粗多糖含量的不确定度评价

苏家杰， 李 盎， 孙家豪， 黄华铖， 王 波

（广州中科检测技术服务有限公司，广东 广州 51000）

近年来，随着社会快速的发展，人们对健康愈发重视。与此同时，竹荪，作为一种珍贵的食用菌，也更加频繁的出现在公众的视野中，因为其具有滋补强壮、益气补脑、宁神健脑的功效[1]，而具有如此强大的功效主要归功于其体内富含多酚与多糖。其中的食用菌多糖的主要作用为抗氧化、强化免疫、抑制肿瘤的作用[2]。

针对竹荪中粗多糖的检测方法，其主要以紫外分光光度计法为检测手段，通过对样品中的粗多糖进行水解为单糖，并通过苯酚与水解后的单糖反应显色反应并与紫外浓度曲线作对比，从而计算出样品中粗多糖的含量，紫外分光光度法的优点是前处理简单、试剂耗材成本低，是测定粗多糖含量的最佳方法。但是因为目前对竹荪中粗多糖含量测定的不确定度研究较少，且在标准溶液配制、曲线拟合及样品前处理中所引入的确定度来源可以量化计算。所以，本文据标准JJG1059.1-2012对该方法行不确定度评定，分析该方法测定结果不确定度的主要来源。从而可以根据该评定结果，有效地较少不确定度对其结果的影响，从而提高该方法测定的准确度。

1 实验

1.1 试剂和仪器

试剂：苯酚（AR，天津市大茂化学试剂厂），浓硫酸（AR，天津市大茂化学试剂厂），无水乙醇（AR，天津市大茂化学试剂厂），D-葡萄糖标准物质（Dr. Ehrenstorfer）。

仪器：紫外可见分光光度计（岛津UV-2600）、分析天平。

材料：竹荪购买于超市。

1.2 实验依据

实验按照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量》的标准进行测定。

1.3 标准溶液配置

准确称取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖0.1 g至1 000 mL A级容量瓶中，加水溶解并定容，准确吸取此标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于20 mL具塞试管中，各加水至1.0 mL，向试液中加入苯酚溶液1.0 mL，然后快速加入5.0 mL硫酸，静置10 min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20 min，于490 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线[3]。

1.4 测定结果计算

测定结果计算如式（1）所示。

式中：m1为从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，µg；V1为样品定容体积，mL；V2为比色测定吋所移取样品测定液的体积，mL；m2为样品质量，g；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

2 结果与讨论

2.1 不确定度因素分析

使用紫外分光光度计测定竹荪中的粗多糖含量测定引入不确定度的主要来源有：重复性实验引入的不确定度、标准物质和配制过程中引入的不确定度、样品处理引入的不确定度，仪器引入的不确定度、曲线拟合引入的不确定度。

2.2 重复性实验引入的不确定度

对竹荪进行10次粗多糖含量的重复测定，其结果如表1所示。

表1 竹荪粗多糖含量测定结果

计算竹荪粗多糖含量的标准方差（见式2）与相对标准方差（见式3）

2.3 标准物质及配制过程中的不确定度

2.3.1 标准物质纯度不确定度

根据葡萄糖标准物质证书查得，其不确定度为0.45%（k＝2）。所以由标准品引入不确定度如式（4）。

2.3.2 称量标准物质引入的不确定度

根据标准，需称取0.1 g葡萄糖于100 mL烧杯中。查阅天平检定证书可得知，其不确定度为U＝0.5 mg（k＝2），所以其标准不确定度为：urel(5)＝0.00005/2＝2.5×10-4，得出相对标准不确定度为：urel(6)＝urel(5)/ m平均质量＝2.5×10-4/0.1007＝0.000248。

2.3.3 体积为1 000 mL与100 mL A级容量瓶的不确定度

标准品称重以后，需转移至1 000 mL A级容量瓶，且定容。依据国标JJG196-2006的规定[4]，在20℃时A级1 000 mL及100 mL容量瓶的容量允许差分别为±0.40 mL与±0.10 mL，根据均匀分布k＝31/2，则这两种容量瓶体积带来的不确定度分别如式（5）、（6）所示。

2.3.4 环境温度变化的不确定度

实验室环境温度控制在20±2℃，此时水的膨胀系数应为2.1×10-4/℃，根据均匀分布k＝31/2，则环境温度所引入的不确定度如式（7）所示。

2.3.5 标准物质不确定度合成

在标准溶液配制的过程中，可能影响竹荪粗多糖定量测定的不确定度进行合成，如式（8）所示。

2.4 样品引入的不确定度

2.4.1 样品称样引入的不确定度

根据标准，需称取0.816 7 g样品至离心管中，并且重复称重10次，所以其不确定度如式（9）所示。

2.4.2 样品定容体积引入的不确定度

样品前处理以后，需将待测液全部转移至100 mL容量瓶中，并且定容。并且在20℃时A级100 mL容量瓶的容量允许差分别为±0.10 mL，根据均匀分布 k＝31/2，则这容量瓶体积带来的不确定度分别如式（10）所示。

2.4.3 样品不确定度合成

根据上述分析，样品所引入的不确定分别为称样10次引入的不确定度、样品前处理完后需在100 mL容量瓶定容所引入的不确定度以及环境温度对水体体积影响引入的不确定度。所以样品合成不确定度的如式（11）所示。

2.5 仪器引入的不确定度

2.5.1 仪器示值引入的不确定度

紫外可见分光光度计（岛津UV-2600）的示值分辨率为0.001，按照JJF 1095.1-2012标准中规定，其引入的不确定度如式（12）所示。

2.5.2 吸光度引入的不确定度

根据该紫外可见分光光度计检定证书可得知，其透射率扩展不确定度U=0.4%，（k=2），由此得出其不确定度如式（13）所示。

2.5.3 仪器引入不确定度合成

2.6 标准曲线拟合引入的不确定度

按照标准方法做出标准曲线，其浓度与吸光度关系如表2所示，其中由最小二乘法计算得到的回归方程为A2＝a＋bCi，截距a＝0.007 899 72，斜率b＝0.009 833 56，相关系数r2＝0.999 58。利用标准曲线求得吸光度的理论值a＋bCi，计算A1与A2的差值，n为标准溶液测定的总次数，所以n＝6，根据贝赛尔公式计算残差标准偏差（14）。

表2 标准曲线与吸光度

相对不确定度如式（16）所示。

2.7 合成不确定度

样品中多糖的标准不确定度分析，测定得出竹荪中多糖含量为0.689 g/100 g，则样品中的多糖标准不确定度如式（17）所示。

所以竹荪的相对合成标准不确定度如式（18）所示。

表3 标准不确定度一览表

2.8 扩展不确定度的评定

设包含因子k＝2，则扩展不确定度u＝2Urel(相对)＝0.019×2＝0.038（g/100 g），所以，竹荪的粗多糖含量可表示为 0.689±0.038（g/100 g）（k＝2）。

3 结论

竹荪中粗多糖含量为 0.689 g/100 g，扩展不确定度为 0.038 g/100 g，因此粗多糖含量为0.689±0.038（g/100 g），根据表（3）标准不确定度一览表中可得出，不确定度中标准曲线拟合的所占的比例最大，达到74.64%，而其次为标准物质及配制过程，为8.97%。所以，在检测的过程中，实验员应选择使用纯度更高标准品且使用精度更高的紫外分光光度计对样品进行粗多糖的测定，从而降低检测结果的不确定度，从而提高检测的准确度。